Текст книги "Полный справочник медицинской аппаратуры"

Глава 4
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

В современных клинико-диагностических лабораториях используются разнообразные методики определения биохимических показателей. В зависимости от метода определения, а также от клинической задачи и материальных возможностей лаборатории, выбор может быть остановлен на различных анализаторах и системах.

В повседневной лабораторной практике для определения основных параметров клинической биохимии (ферментов плазмы и сыворотки крови, основных метаболитов – сахаров, азотистых оснований, пигментов, электролитов плазмы крови и др.) чаще всего используют спектрофотометрические способы определения. Среди используемых для этих целей анализаторов можно выделить три основные группы: спектрофотометры, полуавтоматические биохимические анализаторы и полностью автоматизированные аналитические системы.

Спектрофотометры – это устройства, рассчитанные на регистрацию величины оптической плотности и производящие элементарные математические операции с полученными величинами, которые, в свою очередь, подразделяются на одно– и многоканальные системы. Спектрофотометры между собой различаются по наличию (или отсутствию) ряда дополнительных возможностей, таких как термостатирование пробы, автоматический вычет бланка, вывод результатов на дисплей или на печатную ленту, и т. п. Подготовка реагентов, смешивание и внесение образцов, распределение очередности тестов для всех этих анализаторов осуществляются врачом-лаборантом вручную, поэтому такие методики называют ручными, или мануальными.

Полуавтоматические биохимические анализаторы также требуют участия в своей работе врача-лаборанта, однако, начиная с момента введения реакционной смеси в анализатор, все последующие стадии автоматизированы. Оператор проводит подготовку проб, смешивание реагентов, однако очередность внесения бланка, калибраторов или стандартов определяет прибор, выдавая оператору запрос на их исследование и на внесение следующей пробы. Расчет результатов в полуавтоматических биохимических анализаторах автоматизирован, результаты подаются на дисплей в заранее запрограммированных оператором единицах. Некоторые системы способны оценивать адекватность полученных результатов по бланку, значению, или изменению оптической плотности в ходе кинетического измерения. В наиболее современных полуавтоматических биохимических анализаторах предусмотрена возможность верификации результатов путем построения карт Леви-Дже-нингса и отбраковка недостоверных результатов (или сообщение об их недостоверности). Большинство полуавтоматических биохимических анализаторов имеют встроенный процессор, дисплей, принтер, однако некоторые обладают возможностью подключения к персональному компьютеру или оборудованы записывающим устройством. Вывод результатов осуществляется на дисплей или на принтер.

Полностью автоматизированные биохимические анализаторы осуществляют дозирование реагентов, их смешивание и внесение реакционной смеси в зону анализа автоматически. Участие оператора необходимо только для определения «профиля» (регламента последовательности определения тех или иных параметров), количества анализируемых проб и на стадии программирования тестов.

Практически все автоматические системы оборудованы программным обеспечением, позволяющим оценить достоверность результатов, а при получении недостоверного результата – позволяют повторить анализ с другим разведением пробы. Большинство приборов этого класса подключаются к внешнему персональному компьютеру или имеют встроенный процессор, программное обеспечение в таких анализаторах выполнено в формате операционных систем DOS / Windows.

Общими чертами всех автоматических биохимических анализаторов являются: высокая пропускная способность, невысокий (в сравнении с мануальными методиками и определением на полуавтоматических анализаторах) расход реагента, автоматическая подача и смешивание реагентов.

Основными критериями выбора того или иного анализатора являются его аналитические возможности и математическое обеспечение. Большинство современных биохимических анализаторов способно проводить тесты по конечной точке, регистрацию кинетики фермент-субстратного взаимодействия, определять некоторые другие параметры по заложенным в него или составляющимся в процессе определения калибровочным кривым (например, иммунотурбидиметрический анализ специфических белков или мониторинг лекарственной терапии и ряда других низкомолекулярных метаболитов). Математическое обеспечение биохимических анализаторов зависит от его класса и версии (так, современные версии большинства известных анализаторов уже содержат программы работы с нелинейными калибровками и верификацию результатов по правилам Вестгарда и построение карт Леви-Дженингса). Однако почти каждая фирма-производитель предоставляет и свои, дополнительные, аналитические или программные возможности.

По работе с реагентами полностью автоматизированные анализаторы принято разделять на так называемые «открытые» и «закрытые» системы. Для «закрытых» систем характерно использование ограниченного спектра реагентов, предусмотренного фирмой-изготовителем прибора. В таких системах значения контрольных и калибровочных материалов запрограммированы заранее, а информация о вносимых реагентах регистрируется путем считывания штрих-кода с упаковки.

Положительным аспектом такой организации является достаточно высокая стабильность результатов калибрования, однако имеется и существенный недостаток: «закрытые» системы производят обычно крупные фирмы-изготовители, а затраты на предварительную проверку реагентов, являющуюся залогом столь высокого качества, делают реагенты для закрытых систем достаточно дорогими, тогда как в силу специфики организации закрытых систем вероятность их замены на более экономичные аналоги практически нулевая. «Открытые» системы оборудованы набором светофильтров для проведения наиболее распространенных методик и допускают проведение анализа практически на любых реагентах промышленного производства. Остальные функции: автоматическое дозирование реагентов, подготовка реакционной смеси, внесение пробы, определение ее оптической плотности и верификация полученных результатов с возможностью повторения неудовлетворительных анализов с измененным соотношением реагентов – аналогичны таковым у автоматических «закрытых» систем. Самые современные «открытые» автоматические анализаторы оборудованы сканером штрих-кодов, что позволяет считывать информацию аналогично тому, как это делают закрытые системы.

Открытые автоматические системы разных фирм-изготовителей различаются по конструкции основных блоков (блок реагентов, блок анализируемых образцов и калибровочных материалов, реакционный блок, система считывания результатов и др.). Каждая конструкция имеет свои преимущества и недостатки.

Автоматические биохимические анализаторы различаются также по режиму доступа к тому или иному тесту.

1. Система «тест за тестом» – Batch-доступ, при котором для всех образцов система определяет сначала один параметр, затем следующий и т. п. (подобная система характерна для анализаторов, оборудованных проточной кюветой). Преимуществом является достаточно низкий риск взаимодействия реагентов из наборов для определения различных аналитов, а также быстрый набор статистических данных по определяемому аналиту, что удобно при проведении научных исследований. Серьезным недостатком, особенно для лабораторий, обслуживающих стационары, – невозможность быстрого получения результатов по каждому больному.

2. Система «пациент за пациентом» и/или «тест за тестом» – свободный доступ (Random Access), при котором можно выбрать режим «определение всех параметров для одного образца», или, как и при Batch-режиме, определить один и тот же параметр во всех образцах. Эта система обладает всеми преимуществами Batch-системы, лишена ее недостатков, позволяет проводить экстренное определение любого параметра (Stat-исследования), однако требует грамотного назначения очередности тестов или тщательной специфической промывки (например, растворами кислоты, щелочи или детергентов) между определенными типами анализов. В наиболее современных анализаторах эта проблема решена путем введения списков тестов, запрещенных к последовательной постановке.

В зависимости от конструкции блоков для реагентов, проб и реакционного узла можно выделить два основных типа биохимических анализаторов. Первый тип – это линейный реагентный блок, представляющий собой стрип с гнездами для кювет с реагентами. Чаще всего реагенты хранятся при комнатной температуре, но в ряде современных систем охлаждаются. Серьезным недостатком такой конструкции является необходимость переноса реагентов из промышленных емкостей в специальные кюветы: во-первых, на этом этапе возможно загрязнение реагентов, во-вторых – часть реагента всегда остается в кювете (полный забор практически невозможен) и не подлежит возвращению в основную емкость. Другой тип блока реагентов – карусель, в которую помещают реагенты в промышленных флаконах. При такой конструкции забор реагента осуществляется практически полностью, ошибки, загрязнение реагента и его потери на этом этапе исключены. В самых современных моделях реагентная карусель охлаждается до 10–15 °C, что обеспечивает его качественную работу на протяжении всего срока годности.

Конструкция блока проб (образцов) чаще всего аналогична конструкции реагентного блока, с той лишь разницей, что основным преимуществом карусели является не только возможность использования первичных пробирок, но и возможность установки дополнительных калибраторов и/или образцов в процессе работы прибора. Кроме того, в большинстве приборов с каруселью проб не существует жесткой привязки калибраторов к определенным гнездам, а сами пробы хранятся при комнатной температуре, без дополнительного подогрева.

Реакционный узел может представлять собой проточную кювету (об ограничениях, накладываемых такой конструкцией на пользовательские характеристики прибора), или термостати-руемую платформу с реакционными пробирками или планшетами, которые в свою очередь бывают одноразовые или многоразовые. Использование одноразовых реакционных пробирок в отечественной лабораторной практике является весьма неэкономичным, а на реакцию, протекающую в многоразовых пробирках (планшетах), значительное влияние оказывает качество их промывки (некоторые системы оснащены автоматическими моющими узлами, некоторые требуют внешнего моющего устройства или ручной обработки) и соответствие длительности их использования регламентированному сроку эксплуатации. Любые нарушения на этом этапе могут приводить к нарушению химизма протекающих в блоке процессов и, следовательно, существенно искажать результаты. Поэтому в некоторых современных системах в качестве реакционного блока используется многоразовый реакционный ротор, состоящий из определенного количества кювет из прочного материала и не требующий ручной промывки или дополнительной просушки (все операции осуществляет сам анализатор).

Определенное значение для удобства пользователя и качества получаемых результатов имеют также конструкция охлаждающей системы (при ее наличии), количество дозаторов (желательно наличие независимых дозаторов для проб и реагентов, во избежание загрязнения иглы реагентов белковым материалом из проб больного) и еще целый ряд аспектов, но основное влияние оказывают именно описанные выше параметры.

Экономичность эксплуатации прибора и реагентов повышается по мере уменьшения объемов проб и реагентов, вносимых в кюветы. Для наиболее адекватного использования реагентов немалое значение имеет не только количество потребляемого реагента, но пошаговость его дозирования.

Все реакции имеют свой регламент, обусловленный оптимальным соотношением вступающих в реакцию компонентов, поэтому чем мельче шаг дозирования (как пробы, так и реагента), тем с большей вероятностью можно выдержать точный регламент реакции на малых объемах. Более того, при одинаковой возможной загрузке прибора (например, от 300 мкл реагента на анализ) более экономичной является такая конструкция дозатора, при которой можно установить шаг в 1 мкл, а не в 5 или 10 мкл для реагента, и 0,5–0,7 мкл, а не 1–1,5 мкл для пробы, так как это оставляет пользователю возможность работы с дробными объемами и не вынуждает его увеличивать загрузку реагента, например до 400 мкл, только потому, что невозможно изменить дозирование пробы с 4 на 4,5 мкл.

Таким образом, для оптимального выбора автоматического анализатора необходимо оценивать не только его аналитические возможности и математическое обеспечение, но и конструкцию основных узлов, оказывающую немалое влияние как на риск возникновения системных и случайных ошибок, так и на экономичность расхода реагентов.

Для адекватного выбора анализатора существенное значение имеет не только его производительность и «интеллектуальность», но и соответствие его нуждам конкретной лаборатории и конкретного лечебного учреждения. Во-первых, необходимо определить предполагаемую загрузку прибора (поток пациентов). Во-вторых – учесть возможности штатного расписания и квалификацию персонала. В-третьих – определить, какие именно тесты и в каком количестве предполагается проводить. С этой целью мы предлагаем следующие таблицы выбора (см. табл. 2, 3).

Таким образом, полуавтоматический биохимический анализатор может быть оптимально использован при незначительном потоке пациентов или в случае проведения многочисленных анализов одного или нескольких сходных параметров.

Полностью автоматизированная система необходима при потоке более 10 пациентов в день, в особенности – при широком профиле назначаемых тестов, или при проведении тестов, требующих дополнительного обсчета и верификации результатов.

Существуют две методики подсчета форменных элементов крови: рутинный с использованием камеры Горяева и автоматизированный с использованием автоматических счетчиков и анализаторов.

Подсчет в счетной камере. В данном случае подсчет форменных элементов крови проводят под микроскопом в строго определенном количестве квадратов камеры Горяева. Затем пересчитывают число форменных элементов на 1 мкл и 1 л крови с учетом объема квадратов и разведения крови.

Для подсчета эритроцитов берут 0,02 мл крови, предварительно разведенной в 200 раз в 4,0 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Счетная камера представляет собой толстую стеклянную пластину, с расположенным в центре углублением, равным 0,1 мм. На дне камеры нанесены 2 сетки Горяева, разграниченные поперечной канавкой. Сбоку от сеток расположены стеклянные прямоугольные пластины, к которым притирается шлифованное покровное стекло.

Каждая сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, 25 из которых разделены еще на 16 малых квадратов каждый. Сторона большого квадрата равна 0,2 мм, сторона малого квадрата – 0,05 мм. Соответственно площадь большого квадрата составляет 0,04 мм², малого квадрата – 0,0025 мм². Если учитывать глубину камеры, равную 0,1 мм, то объем одного малого квадрата сетки Горяева составит 2,5 х 10⁴ мкл (см. рис. 6).

Рис. 6. Сетка Горяева для подсчета форменных элементов

Перед заполнением кровью счетную камеру и покровное стекло необходимо тщательно протереть и высушить. Большими пальцами покровное стекло плотно прижимают к боковым пластинам камеры и слегка передвигают его вверх и вниз до тех пор, пока не появятся радужные полосы («ньютоновые кольца»). Только при соблюдении этих условий достигается должный объем камеры.

Перед тем как заполнить камеру взвесью крови в изотоническом растворе необходимо содержимое пробирки несколько раз встряхнуть. Пипеткой набирают небольшой объем взвеси крови и выпускают несколько капель на фильтровальную бумагу. После чего переносят каплю разведенной крови на край покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно заполняла всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в боковые бороздки. Если это случится, то излишки крови необходимо удалить фильтровальной бумагой.

Подсчет эритроцитов проводят при малом увеличении микроскопа.

Эритроциты подсчитывают в 5 расположенных по диагонали сетки квадратах, которые в свою очередь разделены на малые, то есть подсчет ведется в 80 малых квадратах. Для этого под микроскопом находят верхний левый большой квадрат сетки (разделенный на 16 малых) и начинают подсчитывать число эритроцитов с него. При этом целесообразно придерживаться определенной последовательности подсчета эритроцитов: передвигаться из одного малого квадрата в другой по горизонтали, например один ряд – справа налево, другой ряд – слева направо и т. д., как показано на рисунке.

В каждом малом квадрате подсчитывают эритроциты, находящиеся внутри него, а также расположенные, например, на левой и верхней границах квадрата, пропуская эритроциты, лежащие на нижней и правой границах. Это позволяет добиться того, чтобы клетки, расположенные на границе квадратов, не считались дважды.

Количество эритроцитов в 1 мкл (1 мм³) крови рассчитывают по формуле:

X = a х 200/b х 80,

где Х– число эритроцитов в 1 мкл крови, а – число сосчитанных эритроцитов, Ь – объем малого квадрата (2,5 х 10^-4 мкл), 200 – разведение крови, 80 – число малых квадратов, в которых производился счет.

Если ввести в эту формулу значение объема одного малого квадрата сетки Горяева, можно получить упрощенную формулу подсчета форменных элементов:

Х = а х 200/80 х 2,5 х 10^-4 = а х 200/200 х 10^-4 = а/10^-4 = а х 10⁴.

Количество эритроцитов в 1 мкл (Х)равно числу форменных элементов крови, подсчитанных в 80 малых квадратах, умноженному на 10⁴:

Х= а х 10⁴.

Например, в 5 больших квадратах (80 малых) сосчитано 456 эритроцитов. Тогда количество эритроцитов в 1 мкл составит 4 560 000, или примерно 4,5 х 10⁶/мкл. Учитывая, что в 1 л жидкости содержится 10⁶ мкл, число подсчитанных эритроцитов можно выразить следующим образом: 4,5 х 10¹²/л. Это последнее обозначение числа форменных элементов является в последние годы общепринятым.

Подсчет количества лейкоцитов в счетной камере проводят аналогичным образом. Однако каплю крови (0,02 мл) разводят в 20 раз 3–5%-ным раствором уксусной кислоты (0,4 мл), гемоли-зирующей эритроциты. Затем разведенной взвесью клеток заполняют счетную камеру Горяева, как описано выше. Заполненную камеру оставляют на 1 мин для оседания лейкоцитов, после этого устанавливают ее на столик микроскопа и при малом увеличении подсчитывают лейкоциты в 100 больших квадратах сетки Го-ряева, не разделенных на малые квадраты и полосы. Так же как и при подсчете эритроцитов, считают клетки, расположенные внутри квадрата и на его левой и верхней границах.

Расчет общего количества лейкоцитов проводят по формуле:

Х = а х 20/100 х Ь,

где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови;

а – число посчитанных лейкоцитов;

Ь – объем одного большого квадрата (4,0 х 10^-3 мкл);

20 – разведение крови;

100 – число больших квадратов, в которых производился счет.

Введя в эту формулу значения объема одного большого квадрата, получим:

X = а х 20/100 х (4 х 10^-3) = а х 20/400 х 10^-3 = а х 50/мкл.

Таким образом, количество лейкоцитов в 1 мкл равно числу клеток, посчитанных в 100 больших квадратах, умноженному на

50:

X = а х 50.

Пример: в 100 больших квадратах сосчитано 130 лейкоцитов. Тогда количество лейкоцитов в 1 мкл составит (130 х 50) = 6500, или 6,5 х 10³/мкл. Учитывая, что в 1 мкл крови содержится 10⁶ мкл, число посчитанных лейкоцитов можно выразить следующим образом: 6,5 х 10⁹/л.

Поскольку подсчет количества форменных элементов в камере Горяева представляет собой весьма трудоемкое исследование, в клинической практике все чаще используют специальные автоматические счетчики клеток крови и гематологические автоматы, работа которых основана на разных принципах.

По механизму работы они все делятся на две большие группы: кондуктометрические, оптические с использованием в качестве источников света лазеров (проточные цитометры).

В основе работы кондуктометрических анализаторов лежит изменение электрического сопротивления. Определенное количество разведенной изотоническим раствором натрия хлорида или другим электролитом крови пропускают через микроотверстие. Проходящая клетка увеличивает сопротивление между электродами, возникающий импульс передается на счетное устройство с цифровой индикацией. Данная методика была предложена братьями Культер в 1947 г.

Однако если в один момент в канале находятся две клетки, то будет зарегистрирован только один импульс, что приведет к ошибке подсчета клеток. Во избежание таких ошибок, нужно развести пробу крови до такой концентрации клеток, при которой в канале датчика всегда будет не больше одной клетки.

Чтобы определить необходимую степень разведения цельной крови, нужно знать объем измерительного канала (V канала). Если в объеме измерительного канала в среднем находится одна клетка, то концентрация равна канала. Однако при этом вероятность того, что в канале могут находиться две и более клеток, достаточно велика. По законам математической статистики вероятность одновременного прохождения двух клеток через канал ничтожно мала, если концентрация клеток в 10 раз меньше, чем канала. При диаметре канала 80 мкм и длине 100 мкм получаем объем 0,5 мм³. Чтобы уменьшить концентрацию клеток цельной крови (5 000/мм³) до нужной величины, необходимо выполнить разведение в 5 000 х 0,5 х 10 = 25 000 раз.

Раздельное определение эритроцитов и тромбоцитов в современных анализаторах решается просто: тромбоциты (небольшие по размеру клетки) при прохождении измерительного канала генерируют электрические импульсы низкой амплитуды, а клетки большего размера – эритроциты – импульсы высокой амплитуды. Устройство, которое разделяет импульсы по величине амплитуды, – дискриминатор. В современных анализаторах применяются многоканальные дискриминаторы, позволяющие получить детальную информацию о размерах клеток в виде гистограмм, поскольку каждый канал соответствует определенному объему клеток. Выделив на гистограмме зону объемов клеток, соответствующих эритроцитам, и просуммировав данные, полученные по всем каналам, можно получить общее количество прошедших через датчик эритроцитов. Если при суммировании результатов подсчета эритроцитов значение каждого канала умножать на величину объема соответствующего канала, то получится величина суммарного объема, который занимают эритроциты – гематокрит. При делении гематокрита на концентрацию эритроцитов можно получить еще одну характеристику эритроцитов – средний объем.

Аналогичные показатели можно получить и для тромбоцитов: концентрацию тромбоцитов, тромбокрит, средний объем тромбоцитов.

Поскольку размеры лейкоцитов близки к размерам эритроцитов, их не удается разделить вышеописанным методом. При использовании кондуктометрических счетчиков в подсчет эритроцитов неизбежно будут вносить вклад лейкоциты. Однако за исключением явных лейкоцитозов их вклад будет ничтожно мал, так как в норме концентрация эритроцитов в крови на 3 порядка превышает концентрацию лейкоцитов. В то же время при определении концентрации лейкоцитов необходимость разрушения эритроцитов очевидна. Эта задача оказалась легко решаемой, так как свойства мембран эритроцитов и лейкоцитов существенно различаются. В частности, эритроциты легко лизируются под воздействием многих поверхностно-активных веществ, при этом лейкоциты, хотя и претерпевают некоторые изменения, но остаются целыми. Таким образом, при подсчете лейкоцитов, прежде чем пропустить разведенную суспензию крови через апертуру датчика, к ней добавляют раствор поверхностно-активного соединения (лизирующий раствор или гемолитик). Под действием гемолити-ка эритроциты разрушаются до очень мелких осколков, которые при подсчете лейкоцитов генерируют электрические импульсы очень низкой амплитуды, не влияющие на результат анализа.

Для гематологических анализаторов с дифференциацией лейкоцитарной тройки используется специальная композиция растворителя и гемолитика, в которой различные формы лейкоцитов претерпевают изменения размеров в разной степени и благодаря этому могут разделяться кондуктометрическим методом. Область малых объемов формируется лимфоцитами, которые под действием гемолитика значительно уменьшаются в объеме. Грануло-циты, напротив, расположены в области больших объемов. Между двумя пиками расположена зона так называемых «средних лейкоцитов», в которую попадают моноциты, базофилы, эозино-филы и плазматические клетки (см. рис. 7).

Все современные гематологические автоанализаторы измеряют и концентрацию гемоглобина, для чего у них имеется встроенный гемоглобинометр. При этом измерение концентрации гемоглобина происходит параллельно с определением концентрации лейкоцитов.

Оптические гематологические анализаторы в своей работе используют эффекты светорассеяния и флуоресценции, часто такие устройства называют проточными цитометрами. Измерение светорассеяния на клетках крови в проточных цитометрах производится в определенные телесные углы: 5°, 10°, 90°. Таким же образом измеряется деполяризация светорассеяния от клеток в 90°. Сочетание упомянутых сигналов светорассеяния применяется для дифференцировки лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, базо-филов, эозинофилов. Рассеяние в телесные углы 5° и 10° используют для измерения объема и концентрации гемоглобина эритроцитов. В измерительной камере устройства молекулы некоторых клеточных структур, пересекая луч монохромного лазера, поглощают свет определенной длины волны и переходят в возбужденное состояние. Через короткое время клетки возвращаются в исходное состояние, но при этом испускают кванты света с иными длинами волн. Это вторичное излучение, имеющее строго определенные для каждого вида клеток или их структур длины волн, проходит через оптическую систему прибора и регистрируется фотоэлектронным умножителем, который преобразует его в электрические сигналы, которые затем обрабатываются с помощью компьютера.

Физические свойства клеток (размер или цитоплазматическая гранулярность) могут быть измерены на любой отдельной неокрашенной клетке. Клетки также могут быть помечены специфическими красителями, окрашивающими ДНК, РНК или белок, или целым набором флюорохром-конъюгированных антител, направленных к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток.

Метод проточной цитометрии позволяет существенно увеличить объем информации, снимаемой с анализируемой частицы по светорассеянию. Только с использованием этой методики можно измерить индикатрису светорассеяния индивидуальной частицы. Индикатриса светорассеяния – это зависимость интенсивности рассеянного света от угла рассеяния. Причем диапазон измеряемых углов в проточных цитометрах составляет 5-120°. Технология проточной цитометрии включает в себя не только измерения индикатрисы светорассеяния, но и методы решения обратной задачи светорассеяния, т. е. методы, позволяющие получать информацию о морфологии клетки из индикатрисы светорассеяния. Таким образом, измерение и обработка индикатрис светорассеяния от клеток позволяют не только дифференцировать клетки крови, но и характеризовать эти клетки: определять их размер, форму, структуру, состав и т. д.

Технология проточной цитометрии имеет ряд преимуществ перед описанными выше методиками.

1. Если изображение в микроскопе является двумерной проекцией клетки, то индикатриса светорассеяния является своего рода одномерным отображением клетки и содержит не меньше информации о характеристиках клетки. В случае каких-либо патологических явлений в клетке можно создавать банк данных индикатрис светорассеяния патологических клеток, точно так же как это уже сделано для микроскопных изображений, и не прибегая к микроскопу в реальном времени производить анализ.

2. Благодаря развиваемым подходам в решении обратной задачи светорассеяния контроль качества работы прибора может осуществляться ежедневным измерением калибровочных сфер определенного размера, а не по крови здорового донора и контрольных измерений калибровочной крови.

3. Использование большого количества информации, содержащейся в индикатрисе светорассеяния, повышает способность проточных цитометров к дифференцировке клеток крови по сравнению с другими гематологическими анализаторами. Благодаря этому в анализах можно исключить использование некоторых химических реагентов.

4. Кинетические измерения индикатрис светорассеяния клеток в процессе реагирования на какое-либо воздействие в сочетании с развиваемой кинетической моделью данного процесса позволяют определять многие дополнительные характеристики клеток. Так, при измерении процесса лизиса и сферизации эритроцитов можно измерить их дополнительные характеристики, такие как площадь, проницаемость и жесткость мембраны.

В настоящее время все проточные цитометры по производительности можно разделить на две группы:

1) простые в использовании и обслуживании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10° (малоугольное прямое рассеяние) и 90°;

2) большие клеточные анализаторы, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с заданным набором этих параметров.

Сегодня проточная цитометрия – ведущий метод в клинической иммунологии. В клинической гематологии он может быть использован для решения следующих задач:

1) иммунофенотипирования лимфоцитов, включая определение количества СD4, СD8 клеток и даже ТН1 и ТН2 (по продукции специфических цитокинов);

2) анализа процессов клеточной активации на основе определения маркеров ранней активации: СБ25 (рецептор интерлейки-на-2), СD38, СD69, СD71 (трансферриновый рецептор), СD95 (антиген апоптоза), СD122, анти-HLA-DR;

3) определения маркеров пролиферативной активности клеток иммунной системы (Ki-67, PCNA, Cyclin D3);

4) оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями;

5) иммунофенотипирования острых лейкозов и лимфом;

6) анализа клеточного цикла с определением распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия);

7) детекции и наблюдения минимальной резидуальной болезни (МRD);

8) анализа маркеров апоптоза (аннексина V, CD95 Fas/APO-1, CD95L, Bcl-2, P53).

В качестве примера устройств, использующих в своей работе методику проточной цитометрии, может послужить проточный цитометр EPICS 4 XL фирмы Beckman Coulter (США).

Проточный цитометр EPICS 4 XL