Текст книги "Медицинская микробиология: конспект лекций для вузов"

2. Вирусные белки

Вирусные белки по локализации в вирионе делятся на:

капсидные,

белки суперкапсидной оболочки,

геномные.

Белки капсидной оболочки у нуклеокапсидных вирусов выполняют защитную функцию – защищают вирусную нуклеиновую кислоту от неблагоприятных воздействий, – и рецепторную (якорную) функцию, обеспечивая адсорбцию вирусов на клетках хозяина и проникновение в них.

Белки суперкапсидной оболочки, как и белки капсидной оболочки, выполняют защитную и рецепторную функции. Это сложные белки – липо– и гликопротеиды. Некоторые из этих белков могут формировать морфологические субъединицы в виде шипованных отростков и обладают свойствами гемагглютининов (вызывают агглютинацию эритроцитов) или нейраминидазы (разрушают нейраминовую кислоту, входящую в состав клеточных стенок).

Отдельную группу составляют геномные белки, они ковалентно связаны с геномом и образуют с вирусной нуклеиновой кислотой рибо– или дезоксирибонуклеопротеиды. Основная функция геномных белков – участие в репликации нуклеиновой кислоты и реализации содержащейся в ней генетической информации, к ним относятся РНК-зависимая РНК-полимераза и обратная транскриптаза.

В отличие от белков капсидной и суперкапсидной оболочки, это не структурные, а функциональные белки.

Все вирусные белки выполняют и функцию антигенов, поскольку являются продуктами вирусного генома и, соответственно, чужеродными для организма хозяина.

Представители царства Vira по типу нуклеиновой кислоты делятся на 2 подцарства – рибовирусные и дезоксирибовирусные. В подцарствах выделяют семейства, рода и виды. Принадлежность вирусов к тому или иному семейству (всего их 19) определяется:

строением и структурой нуклеиновой кислоты,

типом симметрии нуклеокапсида,

наличием суперкапсидной оболочки.

Принадлежность к тому или иному роду и виду связана с другими биологическими свойствами вирусов:

размер вирионов (от 18 нм до 300 нм),

способность размножаться в культурах ткани и курином эмбрионе,

характер изменений, происходящих в клетках под воздействием вирусов,

антигенные свойства,

пути передачи,

круг восприимчивых хозяев.

Вирусы – возбудители болезней человека относятся к 6 ДНК-содержащим семействам (поксвирусы, герпесвирусы, гепаднавирусы, аденовирусы, паповавирусы, парвовирусы) и 13 семействам РНК-содержащих вирусов (реовирусы, тогавирусы, флавирусы, коронавирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы, рабдовирусы, бунъявирусы, аренавирусы, ретровирусы, пикорнавирусы, калицивирусы, филовирусы).

3. Процессы взаимодействия вируса с клеткой макроорганизма

Взаимодействие вируса с клеткой – это сложный процесс, результаты которого могут быть различны. По этому признаку (конечный результат) можно выделить 4 типа взаимодействия вирусов и клеток:

продуктивная вирусная инфекция – это такой тип взаимодействия вируса с клеткой, при котором происходит репродукция вирусов, а клетка погибает (для бактериофагов такой тип взаимодействия с клеткой называют литическим). Продуктивная вирусная инфекция лежит в основе острых вирусных заболеваний, а также в основе условных латентных инфекций, при которых погибают не все клетки пораженного органа, а только часть, а остальные неповрежденные клетки этого органа компенсируют его функции, вследствие чего заболевание некоторое время не проявляется, пока не наступит декомпенсация;

абортивная вирусная инфекция – это такой тип взаимодействия вируса с клеткой, при котором репродукция вирусов не происходит, а клетка, избавляется от вируса, функции ее при этом не нарушаются, поскольку это происходит только в процессе репродукции вируса;

латентная вирусная инфекция — это такой тип взаимодействия вируса с клеткой, при котором происходит репродукция и вирусов, и клеточных компонентов, но клетка не погибает; при этом клеточные синтезы преобладают, и поэтому клетка достаточно длительно сохраняет свои функции – этот механизм лежит в основе безусловных латентных вирусных инфекций;

вирус-индуцированные трансформации – это такой тип взаимодействия вируса с клеткой, при котором клетки, пораженные вирусом, приобретают новые, ранее не присущие им свойства. Геном вируса или его часть встраивается в геном клетки, и вирусные гены превращаются в группу клеточных генов. Этот интегрированный в хромосому клетки-хозяина вирусный геном называется провирус, а такое состояние клеток обозначается как вирогения.

При любом из указанных типов взаимодействия вирусов и клеток можно выделить процессы, направленные на то, чтобы доставить вирусную нуклеиновую кислоту в клетку, обеспечить условия и механизмы ее репликации и реализации содержащейся в ней генетической информации.

Вопрос 38. Особенности репродукции вирусов

1. Проникновение вируса в клетку. Репрессия клеточного генома

Продуктивная вирусная инфекция осуществляется в три периода:

• Начальный период включает стадии адсорбции вируса на клетке, проникновения в клетку, дезинтеграции (депротеинизации) или «раздевания» вируса. Вирусная нуклеиновая кислота была доставлена в соответствующие клеточные структуры и под действием лизосомальных ферментов клетки освобождается от защитных белковых оболочек. В итоге формируется уникальная биологическая структура, инфицированная клетка содержит два (собственный и вирусный) генома и один (клеточный) синтетический аппарат.

После этого начинается вторая группа процессов репродукции вируса, включающая средний и заключительный период, во время которых происходят репрессия клеточного и экспрессия вирусного генома. Репрессию клеточного генома обеспечивают низкомолекулярные регуляторные белки типа гистонов, синтезируемые в любой клетке. При вирусной инфекции этот процесс усиливается, теперь клетка представляет собой структуру, в которой генетический аппарат представлен вирусным геномом, а синтетический аппарат – синтетическими системами клетки.

2. Репликация вируса

Дальнейшее течение событий в клетке направлено на репликацию вирусной нуклеиновой кислоты (синтез генетического материала для новых вирионов) и реализацию содержащейся в ней генетической информации (синтез белковых компонентов для новых вирионов). У ДНК-содержащих вирусов, как в прокариотических, так и в эукариотических клетках, репликация вирусной ДНК происходит при участии клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. При этом у однонитевых ДНК-содержащих вирусов сначала образуется комплементарная нить, – так называемая репликативная форма, которая служит матрицей для дочерних молекул ДНК.

3. Трансляция

Реализация генетической информации вируса, содержащейся в ДНК, происходит следующим образом: при участии ДНК-зависимой РНК-полимеразы синтезируются и-РНК, которые поступают на рибосомы клетки, где и синтезируются вирусспецифические белки. У двунитевых ДНК-содержащих вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина это собственный геномный белок. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки, используют содержащуюся там клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу.

У РНК-содержащих вирусов процессы репликации их генома, транскрипции и трансляции генетической информации осуществляются иными путями. Репликация вирусных РНК, как минус, так и плюс-нитей, осуществляется через репликативную форму РНК (комплементарную исходной), синтез которой обеспечивает РНК-зависимая РНК-полимераза – это геномный белок, который есть у всех РНК-содержащих вирусов. Репликативная форма РНК минус-нитевых вирусов (плюс нить) служит не только матрицей для синтеза дочерних молекул вирусной РНК (минус нитей), но и выполняет функции и-РНК, т. е. идет на рибосомы и обеспечивает синтез вирусных белков (трансляция).

У плюс-нитевых РНК-содержащих вирусов функцию трансляции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется через репликативную форму (минус-нить) при участии вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз.

У некоторых РНК-содержащих вирусов (реовирусы) имеется совершенно уникальный механизм транскрипции. Он обеспечивается специфическим вирусным ферментом – ревертазой (обратной транскриптазой), и называется обратной транскрипцией. Суть ее состоит в том, что в начале на матрице вирусной РНК при участии обратной транскрипции образуется транскрипт, представляющий собой одну нить ДНК. На нем с помощью клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется вторая нить и формируется двунитевой ДНК-транскрипт. С него обычным путем через образование и-РНК происходит реализация информации вирусного генома.

Результатом описанных процессов репликации, транскрипции и трансляции является образование дочерних молекул вирусной нуклеиновой кислоты и вирусных белков, закодированных в геноме вируса.

После этого наступает третий, заключительный период взаимодействия вируса и клетки. Из структурных компонентов (нуклеиновых кислот и белков) на мембранах цитоплазматического ретикулума клетки собираются новые вирионы. Клетка, геном которой был репрессирован (подавлен), обычно гибнет. Вновь сформировавшиеся вирионы пассивно (в результате гибели клетки) или активно (путем почкования) покидают клетку и оказываются в окружающей ее среде.

Таким образом синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков и сборка новых вирионов происходит в определенной последовательности (разобщен во времени) и в разных структурах клетки (разобщен в пространстве), в связи с чем способ репродукции вирусов и был назван дизъюнктивным (разобщенным).

При абортивной вирусной инфекции процесс взаимодействия вируса с клеткой по тем или иным причинам прерывается до того, как произошло подавление клеточного генома. Очевидно, что в этом случае генетическая информация вируса реализована не будет и репродукции вируса не происходит, а клетка сохраняет свои функции неизменными.

При латентной вирусной инфекции в клетке одновременно функционируют оба генома, а при вирус-индуцированных трансформациях вирусный геном становится частью клеточного, функционирует и наследуется вместе с ним.

Вопрос 39. Культивирование вирусов в культурах тканей

1. Характеристики тканевых культур

Для культивирования вирусов используют ряд методов. Это культивирование в организме экспериментальных животных, развивающихся куриных вибрионах и культурах тканей (чаще – эмбриональные ткани или опухолевые клетки). Для выращивания клеток тканевых культур используют многокомпонентные питательные среды (среда 199, среда Игла и др.). Они содержат индикатор измерения Ph среды и антибиотики для подавления возможного бактериального загрязнения.

Культуры тканей могут быть переживающими, в которых жизнеспособность клеток удается сохранить лишь временно, и растущими, в которых клетки не только сохраняют жизнедеятельность, но и активно делятся.

В роллерных культурах клетки ткани фиксированы на плотной основе (стекло) – чаще в один слой (однослойные), а в суспензированных – они взвешены в жидкой среде.

По количеству пассажей, выдерживаемых растущей культурой тканей, среди них различают:

первичные (первично-трипсинизированные) культуры тканей, которые выдерживают не более 5—10 пассажей;

полуперевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются не более чем в 100 генерациях;

перевиваемые культуры тканей, которые поддерживаются в течение неопределенно длительного срока в многочисленных генерациях.

• Чаще всего используются однослойные первично-перевиваемые и перевиваемые тканевые культуры.

2. Цитопатическое действие вирусов

О размножении вирусов в культуре ткани можно судить по цитопатическому действию (ЦПД):

деструкции клеток,

изменению их морфологии,

формированию многоядерных симпластов или синтиция в результате слияния клеток.

в клетках культуры ткани при размножении вирусов могут образовываться включения – структуры, не свойственные нормальным клеткам.

Включения выявляются в окрашенных по Романовскому-Гимза мазках из зараженных клеток. Они бывают эозинофильные и базофильные.

По локализации в клетке различают:

цитоплазматические,

ядерные,

смешанные включения.

Характерные ядерные включения формируются в клетках, зараженных вирусами герпеса (тельца Каудри), цитомегалии и полиомы, аденовирусами, а цитоплазматические включения – вирусами оспы (тельца Гварниери и Пашена), бешенства (тельца Бабеша-Негри) и другие.

О размножении вирусов в культуре ткани также можно судить по методу «бляшек» (негативных колоний). При культивировании вирусов в клеточном монослое под агаровым покрытием на месте пораженных клеток образуются зоны деструкции моносом. Так называемые «стерильные пятна», или бляшки. Это дает возможность не только определить число вирионов в 1 мл среды (считается, что одна бляшка является потомство одного вириона), но и дифференцировать вирусы между собой по феномену бляшкообразрования.

Следующим методом, позволяющим судить о размножении вирусов (только гемагглютинирующих) в культуре ткани, можно считать реакцию гемадсорбции. При культивировании вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью, может происходить избыточный синтез гемагглютининов. Эти молекулы экспрессируются на поверхности клеток культуры ткани, и клетки культуры ткани приобретают способность адсорбировать на себе эритроциты – феномен гемадсорбции. Молекулы гемагглютинина накапливаются и в среде культивирования, это приводит к тому, что культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретет способность вызывать гемагглютинацию.

Наиболее распространенным методом оценки размножения вирусов в культуре ткани является метод «цветной пробы». При размножении в питательной среде с индикатором незараженных клеток культуры ткани вследствие образования кислых продуктов метаболизма она изменяет свой цвет. При репродукции вируса нормальный метаболизм клеток нарушается, кислые продукты не образуются, среда сохраняет исходный цвет.

Вопрос 40. Механизмы противовирусной защиты макроорганизма

1. Неспецифические механизмы

Существование вирусов в двух (внеклеточной и внутриклеточной) формах предопределяют и особенности иммунитета при вирусных инфекциях. В отношении внеклеточных вирусов действуют те же неспецифические и специфические механизмы антимикробной резистентности, что и в отношении бактерий.

Клеточная ареактивность, один из неспецифических факторов защиты. Она обусловлена отсутствием на клетках рецепторов для вирусов, что делает их невосприимчивыми к вирусной инфекции. К этой же группе защитных факторов можно отнести лихорадочную реакцию, выделительные механизмы (чихание, кашель и другие).

В защите от внеклеточного вируса участвуют:

система комплемента,

пропердиновая система,

NK-клетки (естественные киллеры),

вирусные ингибиторы.

Фагоцитарный механизм защиты мало эффективен в отношении внеклеточного вируса, но достаточно активен в отношении клеток, уже инфицированных вирусов. Экспрессия на поверхности таких вирусных белков делает их объектом макрофагального фагоцитоза. Поскольку вирусы представляют собой комплекс антигенов. То при их попадании в организм развивается иммунный ответ и формируется специфические механизмы защиты – антитела и эффекторные клетки.

2. Специфические механизмы

Антитела действуют только на внеклеточный вирус, препятствуя его взаимодействию с клетками организма и неэффективны против внутриклеточного вируса. Некоторые вирусы (вирус гриппа, аденовирусы) недоступны для циркулирующих в сыворотке крови антител и способны персистировать в организме человека достаточно долго, иногда пожизненно.

При вирусных инфекциях происходит продукция антител классов Ig G и Ig М, а также секреторных антител класса Ig А. Последние обеспечивают местный иммунитет слизистых оболочек на входных воротах, что при развитии вирусных инфекций желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей может иметь определяющее значение. Антитела класса Ig М появляются на 3—5-й день болезни и через несколько недель исчезают, поэтому их наличие в сыворотке обследуемого отражает острую или свежеперенесенную инфекцию. Иммуноглобулины G появляются позже и сохраняются дольше, чем иммуноглобулины М. Они обнаруживаются только через 1–2 недели после начала заболевания и циркулируют в крови в течении длительного времени, обеспечивая тем самым защиту от повторного заражения.

Еще более важную роль, чем гуморальный иммунитет, при всех вирусных инфекциях играет клеточный иммунитет, что связано с тем, что инфицированные вирусом клетки становятся мишенью для цитолитического действия Т-киллеров.

Кроме всего прочего, особенностью взаимодействия вирусов с иммунной системой является способность некоторых из них (так называемые лимфотропные вирусы) поражать непосредственно сами клетки иммунной системы, что приводит к развитию иммунодефицитных состояний.

Все перечисленные механизмы защиты (исключая фагоцитоз зараженных клеток) активны только в отношении внеклеточного вируса. Попав в клетку, вирионы становятся недоступными ни для антител, ни для комплемента, ни для иных механизмов защиты. Для защиты от внутриклеточного вируса в ходе эволюции клетки приобрели способность вырабатывать особый белок – интерферон.

3. Интерфероны

Интерферон – это естественный белок, обладающий противовирусной активностью в отношении внутриклеточных форм вируса. Он нарушает трансляцию и-РНК на рибосомах клеток, инфицированных вирусом, что ведет к прекращению синтеза вирусного белка. Исходя из этого универсального механизма действия, интерферон подавляет репродукцию любых вирусов, т. е. не обладает специфичностью, специфичность интерферона иная. Она носит видовой характер, т. е. человеческий интерферон ингибирует репродукцию вирусов в клетках человека, мышиный – мыши и т. д.

Интерферон обладает и противоопухолевым действием, что является косвенным свидетельством роли вирусов в возникновении опухолей. Образование интерферона в клетке начинается уже через 2 ч после заражения вирусом, т. е. намного раньше, чем его репродукция, и опережает механизм антителообразования.

Интерферон образуют любые клетки, но наиболее активными его продуцентами являются лейкоциты и лимфоциты. В настоящее время методами генной инженерии созданы бактерии (кишечные палочки), в геном которых введены гены (или их копии), ответственные за синтез интерферона в лейкоцитах. Полученный таким образом генно-инженерный интерферон широко используется для лечения и пассивной профилактики вирусных инфекций и некоторых видов опухолей.

В последние годы разработан широкий круг препаратов – индукторов эндогенного интерферона. Их применение предпочтительнее, нежели введение экзогенного интерферона.

Таким образом, интерферон является одним из важных факторов противовирусного иммунитета, но в отличие от антител или клеток-эффекторов он обеспечивает не белковый, а генетический гомеостаз.

Вопрос 41. Вирусные инфекции. Методы диагностики

1. Вирусные инфекции человека

В настоящее время вирусные инфекции составляют преобладающую часть инфекционной патологии человека. Самыми распространенными среди них остаются острые респираторные (ОРВИ) и другие вирусные инфекции, передаваемые воздушно-капельным путем, возбудители которых относятся к абсолютно различным семействам, чаще всего это РНК-содержащие вирусы (вирус гриппа А, В, С, вирус эпидемического паротита, вирусы парагриппа, вирус кори, риновирусы и другие).

Не менее распространены и кишечные вирусные инфекционные заболевания, вызываемые вирусами, также относящимися к различным семействам РНК-содержащих и ДНК-содержащих вирусов (энтеровирусы, вирус гепатита А, ротавирусы, калициновирусы и другие).

Широко распространены во всем мире такие вирусные инфекционные заболевания, как вирусные гепатиты, особенно гепатит В, передаваемый трансмиссивным и половым путем. Их возбудители – вирусы гепатита А, В, С, D, Е, G, TT относятся к разным таксономическим группам (пикорнавирусов, гепаднавирусов и другие), имеют разные механизмы передачи, но все обладают тропизмом к клеткам печени.

Одной из самых известных вирусных инфекций является ВИЧ-инфекция (часто называемая СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита, который является ее неизбежным исходом). Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) – возбудитель ВИЧ-инфекции, относится к семейству РНК-вирусов – Retroviridae, роду лентивирусов.

Весьма распространенны в настоящее время арбовирусные инфекционные заболевания. Естественными хозяевами их возбудителей являются мелкие грызуны и их эктопаразиты. Человеку эти вирусы передаются через укусы кровососущих насекомых, т. е. переносчиками являются членистоногие, поэтому и называются все эти вирусы, независимо от их таксономической принадлежности арбовирусами.

Большинство из них – РНК-содержащие, входят в семейства – тога-, флави-, буньявирусов и являются возбудителями энцефалитов и геморрагических лихорадок. Возбудителями тяжелых форм геморрагических лихорадок (лихорадки Эбола, Марбургская лихорадка и другие) являются фило-, аденовирусы. Но трансмиссивный путь заражения при этих инфекционных заболеваниях не являются единственным. Вышеназванные инфекции в основном представляют собой эндемичные заболевания, но тяжелые вспышки некоторых из этих заболеваний (крымской геморрагической лихорадки, лихорадки западного Нила) имели место в Ростовской и Волгоградской области летом 1999 года.

Кроме инфекционной патологии человека, доказана роль вирусов и в развитии некоторых опухолей животных и человека (онкогенные или онковирусы). Среди известных вирусов, обладающих онкогенным действием, есть представители как ДНК-содержащих (из семейства паповавирусов, герпесвирусов, аденовирусов, поксвирусов), так и РНК-содержащих (из семейства ретрорвирусов, род пикорновирусов) вирусов.