Текст книги "Медицинская микробиология: конспект лекций для вузов"

4. Лабораторная диагностика стрептококковых инфекций

Для бактериологического исследования материал, собранный тампоном со слизистой зева и носа, засевают на чашку Петри с кровяным агаром, ставят в термостат на 3–4 ч при 37 °C. При наличии стрептококков через сутки на агаре вырастают характерные палочки. Для микроскопического исследования изолированную колонию пересевают в жидкую питательную среду (мясопептонный бульон с сывороткой) и через 24 ч выращивания в термостате подвергают исследованию. Мазки окрашивают по Граму или метиленовым синим по Леффлеру. Затем изучают биохимические свойства культур и определяют тип стрептококка с помощью реакции агглютинации на стекле и реакции преципитации с типовыми сыворотками. Из серологических реакций применяют реакцию связывания комплемента (РСК) с сывороткой иммунизированного кролика.

Вопрос 57. Капсульные бактерии

1. Капсульные бактерии

К ним относятся клебсиеллы – это группа грамотрицательных неспорообразующих и неподвижных палочек, которые обладают обычными капсулами и на питательных средах образуют слизь.

Основными видами этого рода являются палочка склеромы (риносклеромы), палочка озены и диплобациллы Фридлендера, вызывающие пневмонию. Капсульные бактерии обнаруживаются в слизи носа и зева больных склеромой и озеной, в мокроте и в тканях легких больных фридлендеровской пневмонией, при инфекциях мочевых путей и в испражнениях человека, а также в объектах внешней среды.

2. Морфология, биология и антигенные свойства капсульных бактерий

Морфология – короткие с закругленными концами палочки, 2–3 мкм в длину и 0,5–1 мкм в ширину, располагаются одиночно или часто попарно. Они не имеют жгутиков и не образуют спор. Слизистая форма микроба окружена широкой овальной или круглой капсулой. Ввиду того, что капсула слабо окрашивается анилиновыми красками для окрашивания самой капсулы препарат обрабатывают этиловым или метиловым спиртом, смешанным с уксусной кислотой и солями некоторых тяжелых металлов.

Биология капсульных бактерий. Культуральные свойства – клебсиеллы хорошо растут и размножаются на простых питательных средах. В качества источника азота и углерода, необходимых для построения белка, они используют аммонийные соли, глюкозу или молочную кислоту.

При определении ферментативной способности ограничиваются всего лишь тремя углеводами: лактозой, глюкозой, сахарозой. На плотных питательных средах нейтральной или слабо щелочной реакции капсульные бактерии дают типичные вязкие, выпуклые колонии, нередко сливающиеся в виде сплошного перламутрового слизистого слоя.

Из всех микробов капсульной группы наименее устойчивой является палочка склеромы (Klebsiella rinoscleromatis). Ценным дифференциально-диагностическим признаком этого микроба является его неустойчивость к действию желчи быка в отличие от других видов клебсиелл. Цитраль обладает бактериостатическими и бактерицидными свойствами в отношении капсульной группы, причем наиболее выраженный эффект отмечен по отношению к палочке склеродермы. Сулема убивает палочки склеромы через 3 ч, фенол через 24 ч. Нагревание до 70ºC капсульных бактерий в водной взвеси приводит к их гибели в течении часа. Капсульные бактерии отличаются значительным разнообразием антигенной структуры в связи с особенностями соматических (S и R) и капсульных (К) антигенов. В настоящее время различают более 60 капсульных типов. Палочка склеромы серологически однообразна и все штаммы палочки склеромы входят в одну антигенную группу.

Известно несколько серотипов палочки озены (Klebsiella ozenae) (К 4, 5 и 6) и большое количество серотипов палочки Фридлендера (Klebsiella pneumoniae) с ее многочисленными капсульными антигенами. Все указанное заставляет использовать комплексно все методы исследования: данные морфологии, культуральных, биохимических и антигенных свойств, для того чтобы отнести данный штамм к определенному виду или группе внутри рода капсульных бактерий.

3. Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика склеромы основана на применении патогистологического, цитологического, бактериологического и серологических методов.

Бактериоскопическое исследование позволяет обнаружить в срезах и в препаратах-отпечатках инфильтратов типичные для склеромной гранулемы гидропические клетки Микулича, гиалиновые шары и плазматические клетки.

Бактериологическое исследование – диагностика склеромы основаны на обнаружении в слизи носа, зева, трахеи, гортани, бронхов, в кусочках полученных путем биопсии, капсульной бактерии и выделение ее в чистой культуре. Посев делают на 2–3 чашки Петри со слабощелочным мясопептонным агаром или глицериновым агаром, затем пересевают культуру в цветной ряд (лактоза, глюкоза, сахароза) для определения ферментации; изучение чувствительности микробов при посеве на агар, смешанный напополам с бычьей желчью; исследование серологических свойств микробов с помощью антисыворотки-1 в реакции связывания комплемента; определение вирулентности культуры в опыте на белых мышах; изучение чувствительности выделенных микробов к лизирующему действию специфического бактериофага.

Бактериофаг палочки склеромы может быть легко обнаружен в летнее время, непосредственно после фильтрации взвеси палочки склеромы из агаровых и бульонных культур. Бактерии других капсульных микробов склеромным фагом не лизируются.

Серологическая диагностика склеромы основана на исследовании сыворотки больного в реакции связывания комплемента с антигеном из слизистой культуры палочки склеромы и реакции агглютинации с антигеном из бесслизистой культуры этого микроба.

Диагностическим титром реакции агглютинации считают титр 1:600 (слабо положительная) а в более высоких титрах 1:3200 как положительную. Лабораторный диагноз заболеваний, вызываемых пневмобациллой Фридлендера основывается исключительно на данных бактериологического анализа (посев на мясо-пептонный агар с последующей дифференциацией и описание морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств выделенных микроорганизмов).

Вопрос 58. Палочка инфлюэнцы

1. Заболевания, вызываемые палочкой инфлюэнцы

Бактерии инфлюэнцы Haemophilus influenza (б. Афанасьева-Пфейффера), встречаясь довольно часто на слизистой оболочке верхних дыхательных путей человека, при ослаблении устойчивости организма к инфекции могут вызвать менингит (особенно у ослабленных детей), острые воспаления дыхательных путей:

пневмонию,

бронхит,

эмпиему плевры,

ларингит, конъюнктивит,

острый хронический отит и другие заболевания.

2. Морфология, биология, культуральные и антигенные свойства

Морфология – маленькая палочка почти кокковидной формы. Очень полиморфны, могут образовывать нити. Неподвижны, спор не образует, грамотрицательны. Бактерии медленно окрашиваются анилиновыми красками; окраску мазка карболовым фуксином, разведенным в 10 раз, нужно производить в течение 5—15 мин.

Биология, культуральные свойства. Большую роль при выращивании на питательных средах играют ростовые витамины – кровь различных животных или водный раствор хлористого гематина и дрожжевой экстракт.

Антигенное строение: серотипы – капсула отдельных штаммов отличаются по антигенным свойствам в связи с присутствием в ней 6 различных полисахаридов.

По капсульным антигенам бактерии инфлюэнцы разделяется на 6 типов: a, b, c, d, e, f. У людей чаще выделяется тип b. С помощью капсульных антигенов можно получить специфические антисыворотки с высоким титром, применение которых дают возможность быстро и точно определить серологические типы палочки инфлюэнцы.

3. Лабораторная диагностика

При воспалении дыхательных путей и среднего уха берут слизь и гной с помощью тампона, при пневмонии собирают мокроту в чашку Петри; при эмпиеме плевры исследуют экссудат, а при менингите – спинномозговую жидкость.

Микроскопия и бактериоскопическое исследование – посев делают на кровяной (шоколадный) агар Левинталя и одновременно на свежий кровяной агар с 10 % крови кролика или лошади. Палочка инфлюэнцы очень неустойчива во внешней среде, быстро погибает при высыхании слизи, мокроты, гноя, потому посев необходимо делать немедленно после взятия материала.

На среде Левинталя колони бактерий вырастают довольно больших размеров, слепки беловатые с гладкой поверхностью, ровные, круглые (у капсульных бактерий). У некапсульных штаммов колонии меньше с неровными краями и выпуклым центром. С колоний делают мазки на предметном стекле, окрашивают фуксином Циля и микроскопируют.

Типичные бактерии подвергают серологическому исследованию и пересевают на жидкие среды для дальнейшего исследования. При пересеве с колоний на жидкие кровяные среды (бульон Левинталя) палочка инфлюэнцы дает гомогенный рост с небольшим осадком на дне. Коккообразные формы дают равномерную слизь. Нитевидные формы дают хлопья. Для диагностики применяют реакцию преципитации с различными жидкостями полученными от больного.

Вопрос 59. Возбудители кокковых пневмоний. Лабораторная диагностика

1. Возбудители пневмоний

Возбудителями пневмонии могут быть различные микроорганизмы, проникающие в дыхательные пути человека из окружающей среды – кокковые (пневмококки, стрептококки, стафилококки) и бациллярные (диплобациллы Флидлендера, палочки Пфейффера). Одним из наиболее частых возбудителей пневмонии, особенно крупозной, является пневмококк. В последнее время часты стафилококковые пневмонии.

2. Забор материала для исследований. Микроскопия мазков

Материалом для исследования служат: мокрота, слизь, взятая стерильным тампоном из носоглотки больного, гной, различные выпоты, пунктаты, кровь. Исследованию подвергают преимущественно мокроту или носоглоточную слизь.

Микроскопическое исследование – делают мазки на двух предметных стеклах; один из мазков окрашивают по Граму, а другой – разведенным карболовым фуксином (краска Пфейффера). При нахождении в мазках ланцетовидных диплококков, окруженных светлой зоной неокрасившейся капсулы ориентировочно устанавливают пневмококковую этиологию. Обнаружение расположенных цепочкой грамположительных кокков позволяет подавить предварительный диагноз стрептококковой инфекции. Характерная морфология расположения группами в виде гроздей винограда и положительной окраски по Граму позволяют установить наличие стрептококков. Обнаружение в мазках мелких грамотрицательных палочек, часто образующих гнездные скопления и нередко полярно окрашенных, указывает на палочку Пфейффера. Грамотрицательные диплобациллы различной величины, окруженные капсулой в виде светлого ореола, говорят о наличии диплобациллы Фридлендера. Микроскопический диагноз ориентировочный и предварительный.

3. Бактериологическое исследование

Точное представление о микробном пейзаже дает:

изучение посевов на кровяном агаре и других средах,

выделение чистых культур из изолированных колоний,

идентификации их.

Пневмококковые пневмонии: для бактериологического исследования материал засевают на чашки Петри, содержащие агар с добавлением 5–7 % дефибринированой кроличьей крови. Посевы на кровяном агаре исследуют через 1–2 суток содержания в термостате при 37°.

Одновременно с изучением внешнего вида колоний производят отсев их в жидкие среды и микроскопирование. Колонии пневмококков на кровяном агаре имеют вид мелких полупрозрачных образований зеленовато-серого цвета, особенно заметного в тонком слое агара, в центре имеют небольшой плотный бугорок и более светлую периферию. Нередко колонии окружены как бы отсвечивающим ореолом. В жидких средах пневмококки вызывают равномерное помутнение без образования пленок и осадка.

Микроскопирование обнаруживает грамположительные парные кокки несколько удлиненной формы с заостренными наружными концами, напоминающими ланцет – ланцетивидные диплококки. Размеры их колеблются в пределах 0,5 на 0,75 до 1 на 1,5 мкм, располагаются одиночно, но могут образовывать короткие цепочки по 3–4 пары кокков. Пневмококки образуют капсулу, которая светлым ободком окружает оба кокка вместе, так как обычными методами окраски капсула не прокрашивается. Пневмококки легко лизируются в присутствии бычьей желчи и желчнокислых солей. Обнаруженные при исследовании культуры пневмококка подвергают дополнительному исследованию – определяют тип пневмококка, вирулентность для белых мышей и устойчивость к действию антибиотиков, а также производят серологические исследования (реакции агглютинации и преципитации – материал от больного берется и типовые пневмококковые сыворотки). Одновременно с посевом на агар исследуемый материал вводят внутрибрюшинно 2 белым мышам весом 18–20 г по 0,5 мл – т. е. ставят биологическую пробу.

4. Особенности лабораторной диагностики стафилококковых пневмоний

Стафилококковая пневмония. Бактериологическое исследование проводится с использованием молочно-солевого и кровяного агара. Для обнаружения стафилококков пользуются материалом (пунктат, выпоты, гной, экссудат), взятым непосредственно из очага болезни (плевральные и легочные полости) а также посевами крови, производимыми в строго стерильных условиях.

Исследования слизи из зева и носа имеют второстепенное значение и лишь дополняют общую картину. 2–3 капли исследуемого материала помещают на поверхность чашки, содержащей молочно-солевой агар, посевы помещают в термостат при 37°. Посевы крови сохраняют в термостате до появления роста (помутнении). Если в течении 4–5 дней роста микробов не обнаруживается, считают отрицательными и уничтожают. Через сутки роста посевы извлекают из термостата и выросшие культуры подвергают изучению.

Колонии стафилококков на твердых средах представляют собой правильные диски с ровными краями, блестящей, умеренно выпуклой поверхностью. Размером от 2 до 4 мм в диаметре. Колонии легко снимаются с агара, немного тягучи, непрозрачны, окрашены в золотисто-оранжевый, лимонно-желтый или белый цвет. На кровяном агаре патогенные штаммы стафилококков, как правило, окружены зоной более или менее выраженного гемолиза. В жидких средах стафилококки вызывают сильное диффузное помутнение, некоторые штаммы с образованием пленки. При стоянии пробирки на дне образуется осадок. Стафилококки грамположительны.

Под микроскопом стафилококки представляют собой довольно правильные сферические кокки с диаметром 0,6 до 0,9 мкм. Располагаются одиночно, попарно и даже короткими цепочками по 2–4 кокка, но основной формой являются неправильные скопления, напоминающие гроздья винограда.

Патогенные штаммы выглядят, как правило, лиловыми, а непатогенные – интенсивно синими. Выделенные из одной колонии штаммы культур стафилококка исследуют на патогенные свойства и чувствительность к антибиотикам. Из посевов крови ежедневно делают высевы на гемоагар и выделенные культуры подвергают тем же исследованиям.

Понятие о патогенности стафилококковой культуры складывается из комплекса свойств изучаемого штамма:

способности вырабатывать пигмент,

вызывать гемолиз эритроцитов,

коагулировать плазму крови,

вырабатывать экзотоксин,

лизироваться типовыми фагами.

Косвенным показателем патогенных стафилококков является их способность лизироваться типовыми стафилококковыми фагами, так как известно, что непатогенные штаммы не лизируются.

Серологическое исследование – наибольшее распространение получило определение уровня стафилококкового антитоксина в сыворотке больных в динамике, т. е. вначале и конце болезни. Принцип титрования основан на нейтрализации гемолитических свойств стафилококкового токсина антитоксином, содержащимся в сыворотке больного. Обычно при наличии стафилококкового заболевания уровень антитоксина в крови больных нарастает в течении болезни, что подтверждает этиологическую роль стафилококка в данном заболевании. У резко ослабленных субъектов нарастание титра антитоксина может и не наблюдаться.

Вопрос 60. Возбудитель малярии

1. Морфологические и культуральные свойства возбудителя малярии

Острый антропонозный трансмиссивный протозооноз. Возбудители малярии – одноклеточные животные (простейшие), относятся к классу спорозоа, подклассу кокцидиа, семейству плазмодий, роду плазмодиум. У человека известно 4 вида возбудителей малярии:

плазмодии вивакс (p.vivax) – возбудитель трехдневной малярии;

плазмодии малярии (p. malariae) – возбудитель четырехдневной малярии;

плазмодии фальсипарум (p. falciparum) – возбудитель тропической малярии;

плазмодии овале (p. ovale) – возбудитель особой формы трехдневной малярии.

Последний вид в естественных условиях встречается в Африке, Палестине, Южной Америке, на Филипиннах, в России существование овале не установлено. Человек в естественных условиях может заразиться через комаров возбудителем малярии обезьян.

2. Цикл развития малярийного плазмодия. Спорогония

Цикл развития малярийных возбудителей осуществляется со сменой хозяев:

половое развитие (спорогония) протекает в организме окончательно хозяина – самки комара рода анофелес;

бесполое развитие (шизогония) – в организме промежуточного хозяина – человека).

Спорогония – попавшие в желудок комара с кровью человека мужские и женские половые клетки плазмодиев (микро– и макрогаметоциты) превращаются в зрелые микро и макрогаметы, которые после оплодотворения проходят ряд последовательных этапов развития (от зиготы до спороцисты) инвазионных форм спорозоитов, накапливающихся в слюнных железах насекомого.

Продолжительность спорогонии определяется видом плазмодиев и температурой окружающего воздуха. При оптимальной температуре воздуха (25 °C), спорогония продолжается 10 дней у плазмодиев вивакс, 12 дней у фальсипарум и 16 дней у малярие и овале. При температуре воздуха ниже 15 °C спорозоиты не развиваются. Дальнейшее развитие спорозоиты получают в организме позвоночного хозяина, в который они проникают при кровососании комара.

3. Шизогония – тканевая и эритроцитарная

Шизогония – в организме человека малярийные паразиты проходит бесполое размножение или шизогония. Шизогония протекает:

в тканевых клетах – тканевая шизогония;

в эритроцитах – эритроцитарная шизогония.

Тело малярийного паразита состоит из цитоплазмы и ядра. Некоторые стадии паразитов содержат пигмент, который окраски не воспринимает, а имеет свой естественный цвет: темно-бурый, золотисто-желтый, коричневый, почти черный (разный у разных видов паразитов).

Заражение человека происходит в результате укуса зараженного комара рода анофелес. Со слюной такого комара в организм человека попадают спорозоиты. Тканевая шизогония протекает в клетках печени. Спорозоиты внедряются в них, округляются, растут, достигая в поперечнике 40–50 мкм и более. В них многократно делятся ядро, а затем сегментируется цитоплазма. В результате образуются тканевые мерозоиты. Часть мерозоитов проникает в эритроциты и дает начало эритроцитарному циклу развития паразитов. Другие мерозоиты проникают вновь в клетки печени, в которых продолжается развитие тканевых форм. Стадии паразитов, развивающиеся в клетках печени, называют тканевыми или экзоэритроцитарными формами. Различают тканевые формы преэритроцитарные, развитие которых в тканевых клетках проходит параллельно развитию эритроцитарных форм. Минимальная продолжительность экзоэритрицитарной шизогонии составляет 8 суток у пл. вивакс, 6 суток у пл. факсипарум, 9 суток у пл. овале и 19–16 суток у пл. малярие. Вследствии политипичности спорозоитов пл. вивакс и пл. овале часть из них (до 8—13 мес после инокуляции), обеспечивает развитие болезни после продолжительной инкубации или возникновение истинных или отдаленных рецидивов болезни.

Эритроцитарная шизогония пл. вивакс, пл. малярие и овале протекает в периферической крови. Возбудитель пл. фальсипарум в периферической крови обычно встречаются только шизонты, кольца.

Остальные стадии шизогонии вплоть до разделения паразита на мерозоиты и развитие половых форм (гамоитов) протекают во внутренних органах. Только в случаях тяжелой коматозной малярии в периферической крови могут наблюдаться и другие стадии цикла шизогонии.

У некоторых штаммов пл. фальсипарум все стадии шизогонии можно обнаружить в периферической крови у значительной части больных и при относительно легком течение болезни.

4. Половое размножение плазмодиев

Размножение паразитов в эритроцитах протекает в виде регулярно сменяющихся циклов. От проникновения мерозоита в эритроцит до завершения развития паразита заканчивающегося образованием новых мерозоитов у пл. вивакс, пл. фальсипарум и пл. овале проходит 48 ч, у пл. малярие – 72 ч. Часть мерозоитов, проникающих в эритроциты, превращаются в мужские и женские половые клетки – гамонты (мужские – микрогамонты, женские – макрогамонты).

Женские гамонты достигают стадии полной зрелости – стадии гаметы в крови человека, мужские гаметы дозревают в организме переносчика. По завершению процесса созревания в желудке комара наблюдается процесс – выбрасывания мужским гаметоцитом 4–8 мужских гамет, которые после отшнуровывания активно двигаются в содержимом желудка, способны проникать в женскую гамету и ее оплодотворять (половой процесс). При пл. фальсипарум гаметоциты сначала принимают округлую форму и лишь затем образуются микрогаметы.

Оплодотворенные женские гаметы (зиготы) проникают сквозь эпителий средней кишки (желудка) комара и под наружней ее оболочкой образуют ооцисты. Ооцисты растут, в них формируются большое число спорозоитов – одноядерных веретеновидных образований (длина 11–15 мкм, ширина 1–1,5 мкм).

Цисты разрываются и выходят из них спорозоиты, распространяясь с гемолимфой по тканям комара, попадают в его слюнные железы, после чего комар становится способным передавать малярию человеку. Заражение малярией может наступит не только через укус комара, но при переливании крови от донора, у которого в крови имеются паразиты даже в весьма малом количестве.