Текст книги "Медицинская микробиология: конспект лекций для вузов"

2. Особенности диагностики

Малая высеваемость стрептококков является, по-видимому, результатом подавления их роста более устойчивым стафилококком, а также реакциями сенсибилизированного организма. Ассоциация стрептококка с другими микробами, чаще со стафилококком, имеет значение в ряде случаев при развитии гнойных местных осложнений, некроза и сепсиса. В этиологии неосложненных форм рожи другие микробы, в том числе стафилококк, значения не имеют. Лабораторные исследования в постановке диагноза значения не имеют.

Вопрос 70. Возбудитель газовой гангрены

1. Морфология, биология и культуральные свойства возбудителя газовой гангрены

Газовая гангрена – заболевание, возникающее в результате попадания в раны патогенных анаэробы после травм, ранений и т. д. Классическая картина газовой гангрены с явлениями мионекроза, отека тканей, сильного газообразования в них, а также общей интоксикации, «гемолитической анемии» бывает обусловлена главным образом Clostridium perfringens типа А. Однако заболевание могут вызывать и другие типы клостридий (В, С, D, Е, F). Как правило возникают ассоциации нескольких типов клостридий со стрептококками, стафилококками, кишечной палочкой.

Морфология: клостридии перфрингенс типов A, B, C, D, E и F – крупные грамположительные образующие капсулу палочки. Жгутиков не имеют, неподвижны, образуют при определенных условиях центральные или субтерминальные споры. Клетки разных штаммов могут отличаться друг от друга по своей толщине и длине. В одних случаях это короткие толстые палочки, в других – длинные нити с заостренным краем клетки в 6–8 очаговых культурах грамположительны, хорошо красятся метиленовым синим и другими основными красками. Старые клетки становятся грамотрицательными. Они не воспринимают метиленовый синий и окрашивают фуксином.

Биология, культуральные свойства возбудителя газовой гангрены. В жидких анаэробных питательных средах, приготовленных из гидролизатов мяса или казеина, при 37–43 °C, клостридии перфрингена всех типов растут быстро (3–8 ч) с бурным газообразованием, изменением рН-среды в кислую сторону. На щелочных средах, богатых белком и не содержащих сбраживающих углеводов возбудители газовой гангрены способны образовывать споры.

Существует три варианта колоний:

гладкие (S),

слизистые (M),

шероховатые (R).

Гладкие формы колоний на поверхности агара в начале роста напоминают пенные капли росы, затем теряют свою прозрачность. Они прочные, сочные, куполообразные, с гладкой блестящей поверхностью и ровным краем. В мазках из S-форм колоний содержатся короткие бескапсульные клетки.

Слизистые (М) колоний похожи на гладкие и отличаются от последних более высоким куполом и слизистой консистенцией. Они состоят из клеток, имеющих капсулу, которые при росте на жидких средах могут образовывать густую слизь.

Шероховатые (R варианты на плотных средах имеют колонии неправильной формы с изрезанным «фестончатым» краем, иногда с отростками в виде шипов и неровную бугристую поверхность.

Колонии возбудителя газовой гангрены, выросшие на поверхности кровяного агара часто окружены одной или двумя зонами гемолиза и при выдерживании на воздухе приобретают зеленоватую окраску. Большинство штаммов клостр. перфригенс обладает слабыми протеолитическими свойствами, вырабатывают ферменты, расплавляющие желатин. Все штаммы сбраживают с образованным кислот и газа глюкозу, галактозу, лактазу, левулезу, мальтозу, сахарозу и не ферментируют маннит.

Образование токсинов – деление клостридии перфрингенс на 6 типов основано на способности этих микроорганизмов вырабатывать различные по своим антигенным свойствами летальные и некротические токсины. Большинство этих веществ выделяется в окружающую среду в процессе роста микроорганизмов, не задерживаясь внутри клеток. Различные типы возбудителя вызывают определенные заболевания людей и животных. Клостридии перфрингенс А, вырабатывающий а-токсин в большом количестве, считается в данное время основным возбудителем газовой гангрены, вызывающим это заболевание в 70–80 % случаев.

2. Устойчивость к физическим и химическим факторам

Устойчивость к физическим и химическим факторам. Токсин Clostridium perfringens относительно быстро (несколько часов) разрушаются под влиянием различных факторов внешней среды.

Наибольшей устойчивостью отличаются прототоксины, которые в неактивной форме могут переносить даже кипячение (до 30 мин – 1 ч). В содержимом кишечника трупов токсины могут сохранять свою активность в течение нескольких часов, а иногда даже суток. Затем они разрушаются.

Устойчивость клостридий перфрингенс к действию различных физических и химических факторов зависит от индивидуальных свойств штамма. Вегетативные формы этих микробов быстро погибают при действии кислорода воздуха, солнечного света, высокой температуры, кислот, щелочей, спиртов, дезинфицирующих средств и антибиотиков, действующих на грамположительную флору. Споры клостридий перфрингенс типов С, Д и Е убиваются обычно при кипячении в течение 15–30 мин. Однако отдельные штаммы типа А образуют термоустойчивые споры, переносящие кипячение или автоклавирование от 1 до 6 ч. Такие споры могут попадать из окружающей среды на сырье, используемое для изготовления различных пищевых продуктов (в том числе консервов) и способны выдержать длительную обработку. При определенных условиях жизнеспособные споры могут прорастать.

3. Лабораторная диагностика газовой гангрены

Лабораторная диагностика газовой гангрены. Для бактериологического исследования на газовую гангрену берут экссудат, кусочки измененной ткани из раны больного, а также кровь из вены. Трупный материал следует брать по возможности быстрее после смерти, так как в ткани трупа могут проникать различные патогенные анаэробные микроорганизмы, всегда имеющиеся в желудочно-кишечном тракте. Все взятые материалы помещают в стерильную герметически закрывающуюся стеклянную посуду и немедленно пересылают в бактериологическую лабораторию. Все пробы подвергают микроскопии. Для этой цели готовят мазки—отпечатки и окрашивают их по Граму. Наличие в пробе большого количества крупных грамположительных палочек служит ориентировочным признаком для подозрения на клостридиальную инфекцию.

Бактериологическое исследование – плотные материалы стерильно измельчают, кровь или экссудат подвергают центрифугированию в течение 30 мин. Взвесь исследуемого материала засевают на кровяной агар, агар Вильсона-Блэра и бензидиновый агар. Посевы инкубируют в анаэробных условиях при 37 °C, просматривают на следующий день и затем через каждые 2 дня (до 7 суток) для выделения подозрительных колоний. Выраженные колонии, вызывающие гемолиз на кровяном агаре проверяют на чистоту и наличие грамположительных палочек (путем микроскопии) и затем отсевают в пробирки с жидкой казеиново-грибной средой под слоем вазелинового масла, либо на анаэробную среду Китта-Тароцци. Выделенные чистые культуры проверяют на токсичность и вирулентность, а также проводят биологическую пробу на лабораторных животных (мышах, морских свинках).

Вопрос 71. Возбудитель столбняка

1. Морфология, биология и культуральные свойства возбудителя столбняка

Столбняк – инфекция, возникающая после различных травм и ранений в связи с загрязнением ран почвой, содержащей столбнячной палочки (Clostridium tetani).

Морфология: возбудитель столбняка – это подвижная палочка 4–8 мкм в длину и 0,4–0,6 мкм в ширину с закругленными концами. Образует крупные споры, в результате этого приобретает вид барабанной палочки. Имеет жгутики, подвижны. Хорошо окрашивается всеми анилиновыми красками. По Граму красится положительно, но в старых культурах встречаются и грамотрицательные особи. Споры окрашиваются плохо. При окраске метиленовым синим или по Граму споры имеют вид колечек. Вегетативная форма бактерий столбняка мало устойчива к воздействию температуры и химических агентов, тогда как их споры обладают значительной устойчивостью. Во влажной среде споры выдерживают нагревание до 80 °C в течение 4–6 ч и более, при кипячении они погибают через 40–50 мин. В сухом состоянии споры переносят еще более высокие температуры, нагревание при 115 °C разрушает их только через 20 мин, споры совершенно не чувствительны к низким температурам. Они годами переносят температуру 40–60 °C, 1 %-ный раствор сулемы или 5 %-ный раствор карболовой кислоты убивает споры только через 10–12 ч. Под действием рассеянного света споры погибают только через длительное время. Будучи защищены от света в почве и на различных предметах внешней среды споры могут сохраняться в течение десятков лет. В условиях анаэробиоза при температуре 37 °C, достаточной влажности и в присутствии аэробных бактерий (стафилококки, сенная палочка и др.) споры прорастают в развивающиеся вегетативные формы.

Биология, культуральные свойства. Возбудитель столбняка – строгий анаэроб и очень чувствителен к кислороду. Микроб хорошо растет в глубине жидких питательных сред, при наличии в них глюкозы, кусочков печени или мышц (среда Китта-Тароцци). Для культивирования столбнячной палочки применяют бульон Мартена (мясо-пептонный с добавлением глюкозы, подщелоченной р-ром соды) среду Вейнберга (мясной агар).

Питательные среды должны иметь нейтральную или слабокислую реакцию. Жидкие среды заливаются слоем вазелинового масла и перед посевом из них удаляют кислород путем кипячения на водяной бане в течение 10–15 мин. Оптимальная температура роста 35–37 °C. На плотных питательных средах – кровяном и печеночном агаре – столбнячная палочка растет только при полном удалении кислорода. На чашках с агаром при температуре 35–37 °C через 2–4 суток вырастают отдельные прозрачные или слегка сероватые колонии величиной 2–5 мм с неровной зернистой поверхностью, края шероховатые, ветвящиеся. На кровяном агаре колония бывает окружена зоной гемолиза. При почве на скошенном агаре в пробирках микроб растет в виде тонких, едва заметных нитевидных отростков, выползающих на поверхность агара. В столбике желатина через 5–6 дней растет в виде елочки, желатина при этом не разжижая.

В биохимическом отношении возбудитель столбняка малоактивен, обладает слабовыраженными сахаролитическими и протеолитическими свойствами.

Антигенная структура – по антигенной структуре возбудитель столбняка неоднороден. Выделяют групповой соматический О-антиген и типоспецифический жгутиковый Н-антиген, по которому различают 10 серологических типов. Все они вырабатывают один и тот же специфический токсин.

2. Токсины

Токсинообразование является важнейшей биологической особенностью вегетативной формы столбнячной палочки. Столбнячный токсин относится к экзотоксинам и состоит из двух фракций:

тетаноспазмина со свойствами нейтротоксина, который поражает двигательные клетки центральной нервной системы и вызывает сокращение поперечно-полосатых мышц;

тетаногемолизина, лизирующего эротроциты.

Экзотоксин является одним из сильнейших бактериальных ядов, уступая по силе лишь ботулиническому токсину. Токсин не содержит углеводов, относится к протеинам. Он малостоек, быстро разрушается под влиянием нагревания, солнечного света, щелочной среды. Ферменты и энзимы желудочно-кишечного тракта не разрушают токсин, но он не всасывается через слизистую оболочку кишечника, в связи с чем безопасен при попадании через рот. Под действием формалина и содержание в термостате при 37–38 °C в течение суток токсин утрачивает ядовитые, но сохраняет антигенные свойства. Полученный таким образом столбнячный анатоксин используют для активной иммунизации против столбняка.

3. Лабораторная диагностика столбняка

Лабораторная диагностика столбняка. Бактериологическое исследование – исследуется материал, взятый из раны:

гной,

кусочки тканей,

инородные тела,

обрывки одежды,

тампоны, закладываемые в рану при перевязке,

перевязочный материал, содержащий выделения из раны,

в случаях столбняка после родов или аборта берут на исследование выделения из влагалища и матки,

при подозрении на столбняк у новорожденного исследованию подвергают выделения из пуповины,

при исследовании трупа также берут материал из раны, если она имеется, из различных воспалительных очагов и старых рубцов.

В некоторых случаях столбняка происходит генерализация инфекции, возбудитель может быть обнаружен во внутренних органах. Поэтому берут на исследование от трупа кровь, кусочки печени и селезенки. Исследование материала производится с целью обнаружения в нем столбнячного токсина и возбудителя столбняка.

Обнаружение столбнячного токсина: исследуемый материал растирают в стерильной ступке, добавляют двойной объем физиологического раствора. Часть материала засевают в 2 флакона с жидкой питательной средой. Для постановки реакции нейтрализации на животных экстракт исследуемого материала вводят внутримышечно 2 мышам по 0,5 мл экстракта, а еще двум мышам те же дозы с противостолбнячной сывороткой. В зависимости от количества токсина симптомы столбняка у животных развиваются на первые или вторые сутки. У животных, получивших токсин с противостолбнячной сывороткой симптомы не появляются, что свидетельствует о наличии в исследуемом материале столбнячного токсина.

Одновременно с постановкой реакции нейтрализации производят посев растертого материала в 2 флакона или 2 пробирки с питательной средой (бульон Мартена, бульон Вейнберга) под слоем вазелинового масла. Перед посевом из среды удаляют кислород путем кипячения 15 мин, а затем охлаждают до 40–50 °C и в нее добавляют 0,5 % глюкозы. После культивирования при температуре 35 °C на 2-е, 4-е, 6-е и 10-е сутки микроскопируют мазки из посевов и исследуют культуральную жидкость на наличие столбнячного токсина. Для этого ставят реакцию нейтрализации с противостолбнячной сывороткой. При обнаружении в посеве столбнячного токсина и наличии грамположительных палочек с крупными спорами дают положительный ответ.

Вопрос 73. Возбудитель сибирской язвы. Морфология и биология

1. Морфологические свойства возбудителя сибирской язвы

Сибирская язва – тяжелое острое инфекционное заболевание человека и животных, которое вызывает сибиреязвенная спорообразующая палочка (Bacillus anthracis). В зависимости от первичного проникновения и последующей локализации этого

микроорганизма развиваются:

кожные,

висцеральные (легочная и кишечная),

висцерально-генерализованные клинические формы болезни.

Сибирская язва может возникать на всех континентах и всех странах в связи с производством, потреблением и обработкой животного сырья (мясо, шерсть, шкуры и т. п.) и уходом за больными животными.

Морфология – это крупный (1–2 х 6—10 мкм) палочковидный неподвижный микроорганизм, с обрубленными под прямым углом концами. В организме встречаются как единичные инкапсулированные палочки, так и их цепочки из 2–3 микробов, окруженные общей капсулой. В последнем случае концы сливаются и цепочка напоминает собой бамбуковую трость. Сибиреязвенные бациллы хорошо окрашиваются анилиновыми красками, грамположительные. Капсулы бывают отчетливо видны при окраске по Романовскому-Гимзе. Для выявления спор используют метод Циля-Нильсена.

2. Биология сибиреязвенного возбудителя, культуральные свойства

Возбудитель сибирской язвы неприхотлив и может развиваться на различных лабораторных средах – на мясопептонном агаре и бульоне, желатине, молоке, экстрактах из семян растений, различных углеводных средах и даже настое сена. Палочка сибирской язвы является факультативным аэробом, поэтому на бактериологических питательных средах, при температуре 37–38 °C, хорошо растет при свободном доступе кислорода.

На поверхности мясопептонного агара возбудитель сибирской язвы вырастает в виде типичных матового цвета, шероховатых безкапсульных колоний, состоящих из сплетений нитей с отростками («львиная грива», «голова медузы»). Гладкие, слизистые полупрозрачные колонии вырастают на поверхности при 80 °C на лошадиной сыворотке, отдельные палочки и цепочки колоний снаружи покрыты капсулой.

В мясопептонном бульон бактерии сибирской язвы дают рост в виде комка ваты на дне пробирки, без помутнения среды. Капсулы при этом не образуются. Капсульная форма этого микроба является вирулентной. Оптимум роста находится в пределах 36 °C.

При истощении и высыхании среды вегетативные формы микроба переходят в споровые. При этом в каждой палочке образуется одна центральная спора. Обязательным условием спорообразования является доступ кислорода и температура в пределах 12—2 °C. В организме человека и в невскрытом трупе споры не образуются. Вегетативные формы без кислорода растут очень медленно. При посеве уколом в столбик агара или желатины растет «елочной верхушкой вниз»; верхняя часть желатины разжижается («пуговка») протеолитическим ферментом.

На кровяном агаре – рост без гемолиза. Молоко свертывается на 2—4-е сутки с последующей пептонизацией. Большинство штаммов разлагают галактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу (медленно), левулезу с образованием кислоты без газа.

Сероводород образуется не всегда. При повышении щелочности в бульонной культуре может иметь место помутнение. Отдельные штаммы одновременно с образованием типичного осадка на дне сосуда с жидкой средой могут вызывать умеренное помутнение жидких сред.

Вирулентность возбудителя сибирской язвы связана с капсулой в организме инфицированных животных. Капсула не только предотвращает фагоцитоз возбудителя, защищает его от воздействия бактерицидных веществ инфицированного организма, но и способствует фиксации капсульных бацилл на клетках, которые затем подвергаются дегенерации и гибели. Бескапсульные сибиреязвенные бациллы этими свойствами не обладают.

Вирулентность бацилл антрацис обусловлена также образованием ими токсина, как капсульными, так и бескапсульными штаммами.

В теле возбудителя сибирской язвы содержится термостабильный «соматический» антиген полисахаридной природы, сохраняющийся длительное время в трупном материале; в капсуле обнаружен протеиновый антиген – полипептид D-глютаминовой кислоты.

Исключительный интерес представляет наследственно измененные штаммы возбудителя сибирской язвы – мутанты, утратившие способность образовывать специфическую капсулу, превратившиеся из высоковирулентных штаммов в вакцинные штаммы, что используется для практических целей. Из наследственно измененных авирулентных штаммов изготавливают иммунопрофилактические вакцины, применяемые в медицинской и ветеринарной практике.

Вопрос 74. Возбудитель сибирской язвы. Устойчивость к физико-химическим факторам. Лабораторная диагностика

1. Устойчивость

Вегетативные формы микробов без доступа кислорода относительно быстро отмирают, особенно под влиянием гнилостной флоры. Они быстро погибают при нагревании до 50 °C в течение 30 мин, при температуре 75—8 °C – через минуту, а при воздействии различных дезинфицирующих средств – от действия сулемы, формальдегида, хлора в обычных концентрациях, гибель возбудителя наступает через несколько мин. К низкой температуре бациллы сибирской язвы весьма устойчивы.

Сибиреязвенные споры высокоустойчивы во внешней среде. В воде сохраняются жизнеспособными в течение нескольких лет, в почве – десятки лет; сухой жар губит их при 140 °C за 3 ч, кипячение – через 45–60 мин. Споры устойчивы и к дезинфицирующим средствам; в шкурах животных, выделанных дублением, они могут сохраняться живыми длительное время, засаливание мяса не уничтожает спор.

Выявление специфических свойств и отношение возбудителя к внешней среде имеют большое значение в связи с трудностями дифференциальной диагностики. В природе широко распространены ложносибиреязвенные палочки, которые морфологически невозможно отличить. Помимо этого имеются и другие спорогенные аэробы, такие как сенная, картофельная, капустная и корневидная палочки, которые могут находиться в различных объектах среды. Из старых лабораторных культур, почвы и сточных вод выделен специфический сибиреязвенный фаг, используемый для дифференциальной лабораторной диагностики возбудителя сибирской язвы.

2. Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика сибирской язвы состоит в:

бактериоскопии нативного материала,

посева его на питательные среды,

заражении животных (биологическая проба),

постановки реакции термопреципитации по Асколи.

Для диагностики сибирской язвы у больных и ретроспективного анализа используют внутрикожную пробу с антраксилом. Для лабораторного исследования от больного в стерильную посуду берут содержимое пустулы, гной, отделяемое карбункула, кровь, мочу, мокроту, испражнения, рвотные массы, соблюдают при этом правила работы с особо опасными инфекциями.

Исследование начинают с бактериоскопии мазков, окрашенных по Граму и анилиновыми красками. Окраску мазков производят также раствором Ребигера на предмет обнаружения капсульных форм бацилл сибирской язвы – капсулы окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, бактерии в темно-фиолетовый. Для бактериологического исследования материал засевают в чашки Петри на мясопептонный агар и в пробирки с мясопептонным бульоном. Через 24 ч выращивания в термостате при 37 °C в положительных случаях на поверхности агара можно видеть матовые шероховатые колони с ворсистыми краями типа «львиной гривы», в пробирках с мясопептонным бульоном сибиреязвенный возбудитель растет на дне пробирки в виде комка ваты. Выделенные культуры в мазках исследуют под микроскопом на морфологию и в висячей капле – на подвижность.

Биологическая проба. Окончательное подтверждение видовой принадлежности, выделенной культуры устанавливают путем подкожного заражения белых мышей, морских свинок, кроликов эмульсией из однодневной агаровой культуры. Наблюдение за животными проводят 10 дней. Павших животных вскрывают: делают мазки – отпечатки из внутренних органов для микрокопирования, производят посевы из крови, сердца, селезенки и инфильтрата на месте инъекции.

Для ускоренной диагностики сибиреязвенной инфекции используют иммунофлюорецентный метод. Этот метод состоит в обработке мазков культур микробов люминесцентными сыворотками и просмотре их в люминесцентном микроскопе – бациллы сибирской язвы выглядят в виде палочек с ободком, светящимся зеленом цветом. Лаборатория может дать предварительное заключение по исследуемому материалу через сутки после его получения и окончательное через 3–4 дня после результатов постановки биологической пробы.

Реакцию термопреципитации по Асколи проводят с целью обнаружения сибиреязвенного антигена. Для этого измельчают кусочки органов трупа, кожи, шерсти животных и кипятят в физиологическом растворе 10–15 мин. Полученный термоэкстракт фильтруют. Фильтрат наслаивают на преципигирующую сыворотку, разлитую в узкие пробирки. В положительных случаях на границе обеих жидкостей появляется мутно-белое кольцо преципитации.

Аллергическая проба состоит во внутрикожном введении 0,1 мл антраксина – антигена, извлекаемого из оболочки сибиреязвенного возбудителя. На месте введения у больных и переболевших сибирской язвой появляются гиперемия и инфильтрат размером 3,5х3 см.