Текст книги "Медицинская микробиология: конспект лекций для вузов"

Вопрос 61. Лабораторная диагностика малярии

1. Обнаружение плазмодиев в толстой капле и мазке крови

Паразитологический диагноз малярии основан на обнаружении паразитов в окрашенных препаратах (толстая капля и мазок) крови. Паразиты могут присутствовать в крови не только во время лихорадочных приступов и промежутков между приступами, следующими один за другим, но и в течении длительных периодов, на протяжении которых не наблюдается повышения температуры.

Наличие паразитов в крови при отсутствии лихорадочных приступов называется паразитоносительством. Такие люди заразны для комаров. При массовых обследованиях следует брать кровь вне зависимости от наличия приступов.

Техника приготовления и окраски мазка – мазок готовят как обычно. После того как мазок высохнет, его фиксируют в 96 % этиловым спирте 15 мин. Или в метиловом спирте в течение 3 мин. Высушенные после фиксации мазки окрашивают краской Романовского, разведенной дистиллированной водой. Окрашивают в течение 30–50 мин, в зависимости от качества краски. После окрашивания препарат споласкивают водой и высушивают на воздухе.

Техника приготовления и окраски толстой капли. На стекле приготовляют мазок, а потом на еще влажный мазок дают упасть капле крови. Капля равномерно растекается, образуя круг. После того как капля высохнет, на мазке простым карандашом делают соответствующую отметку. Препарат без фиксации окрашивают. Затем осторожно (чтобы не смыть каплю) препарат споласкивают водопроводной водой и высушивают. Мазки и толстые капли микроскопируют имммерсионной системой.

2. Морфология малярийных паразитов в мазке и толстой капле

Морфология малярийных паразитов в мазке крови. Мерозоит, внедрившись в эритроцит, превращается в молодой шизонт, обозначаемый как кольцо. Затем паразит, увеличиваясь, принимает амебовидную форму, при этом сохраняется просвет (вакуоль) между ядром паразита и основной частью его цитоплазмы. В цитоплазме паразита появляются зерна пигмента. Амебовидный шизонт заполняет значительную часть эритроцита, затем начинает округляться, вакуоль исчезает (стадия подготовки к делению), пигмент начинает собираться в отдельные пучки.

Для пллазмодия малярие шизонты – лентовидные формы. Ядро паразита начинает делиться, а затем цитоплазма паразита делится так, что к каждому дочернему ядру прилегает отдельный комочек цитоплазмы (меруляция). В результате получается кучка мерозоитов – морула. Пигмент на стадии морулы собран в одну компактную кучу.

У пл. фальсипарум скучивание пигмента наступает еще до полного формирования морулы. Мерозоиты расходятся, попадают в плазму крови, часть из них погибает, часть внедряется в новые эритроциты.

Гамонты. Форма гамонтов у всех малярийных паразитов, за исключением тропической малярии, круглая или слегка овальная. При тропической малярии плазмодий имеет вытянутые гамонты с закругленными концами. Мужские и женские гамонты различаются между собой по величине и структуре ядра интенсивности окраски цитоплазмы). Женские гамонты – ядро небольшое, компактное; цитоплазма красится в интенсивный голубой цвет. Мужские гамонты – ядро большое, цитоплазма красится бледно, часто зона вокруг ядра принимает фиолетовый оттенок.

Морфология малярийных паразитов в толстой капле. В толстой капле, поскольку ее окрашивают в нефиксированном виде, эритроциты выщелачиваются, а малярийные паразиты претерпевают значительную деформацию. При четырехдневной и тропической малярии пораженные эритроциты в толстой капле выщелачиваются полностью, также как и нормальные. При трехдневной малярии в толстой капле строма эритроцитов сохраняется и диагностика малярийного паразита по толстой капле облегчается. Кольца в толстой капле обычно смяты, вытянуты в виде восклицательного знака, иногда разорваны в виде запятой. Амебовидные шизонты часто бывают уплотненными, лентовидные шизонты четырехдневной малярив толстой капле округляются и неотличимы от амебовидных шизонтов. Морулы распознаются в толстой капле легко.

Цитоплазма паразитов в результате воздействия химиотерапевтических препаратов окрашиваются слабее, приобретает стекловидный оттенок, становится вакуолизированной, распадается на отдельные комочки, ядро становится рыхлыми или наоборот более компактными. Иногда пигмент собирается в кучки, выталкивает из паразита. В толстых каплях распознавание таких подвергшихся деформации паразитов становится более трудным, а иногда и невозможным.

Серологическая диагностика малярии включает иммуноферментную агглютинацию, реакцию непрямой гемагглютинацию и другие, которые имеют наибольшее значение в неэндемичных районах.

3. Ошибки диагностики

В мазках крови и толстых каплях малярийные паразиты могут быть приняты за мерозоит, скопление бляшек может симулировать морулу. В препаратах, окрашенных по Романовскому, бляшки отличаются от мерозоитов по следующим признакам: мерозоит состоит из красного ядра и голубой цитоплазмы. Фон бляшки в мазке иногда окрашивается в бледно-голубой цвет, однако ее зернистость принимает красный цвет более светлого оттенка, чем у ядер мерозоитов.

В препаратах могут быть обнаружены также посторонние микроорганизмы, по форме напоминающие малярийных паразитов: грибки, одноклеточные водоросли, свободноживущие простейшие. Некоторые одноклеточные формы с компактным ядром в центре, окрашивающимся по Романовскому в ярко-красный цвет, симулируют гамонты тропической малярии. Их легко отличить по отсутствию пигмента. Свободно живущие простейшие с одним или несколькими жгутами могут быть приняты за стадию образования мужских гамет малярийного паразита.

4. Исследование комаров на зараженность малярийными паразитами

Комаров вскрывают и определяют наличие ооцист на желудке и спорозоитов в слюнных железах. Ооцисты видны в нативных препаратах.

Незрелые ооцисты выглядят в таких препаратах, как круглые гомогенные образования с пигментом, состоящим из нескольких глыбок.

В зрелых ооцистах видны хорошо сформировавшиеся спорозоиты, тесно прилегающие друг к другу. Ряды спорозоитов в виде частокола располагаются по отношению друг к другу под разными углами, в результате чего ооциста приобретает мозаичный вид, при надавливании покровного стекла из ооцист выходят спорозоиты.

В слюнных железах спорозоиты расположены рядами перпендикулярно к протоку слюнных желез, а также в виде конгломератов. В секрете слюнных желез спорозоиты попадают в окружающую жидкость, в которой хорошо заметны вследствие их подвижности.

Вопрос 62. Возбудитель эпидемического сыпного тифа

1. Морфология, биология и антигенные свойства риккетсий Провачека

Эпидемический сыпной тиф. Возбудителем сыпного тифа является риккетсия Провачека, представляющая собой мелкие (длина 0,5–1 мкм), неподвижные микроорганизмы, не образующие спор и капсул. Они полиморфны, кокковидные, чаще в виде гантелей, палочковидные, нитевидные, ультраформные. Грамотрицательны. Хорошо окрашиваются по Романовсому-Гимзе, методом Здродовского и серебрением по Морозову с концентрацией краски по полосам. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, рикетсии Провачека не растут на тканевых средах.

Большие количества их удается получить в лабораторных условиях в легких мышей при интраназальном заражении (легочные культуры), в куриных эмбрионах (яичные культуры), что имеет значение при изготовлении сыпнотифозных вакцин.

В организме больных они паразитируют в цитоплазме эндотелиальных клеток сосудов и серозных оболочек. Риккетсии обладают гемолитическими и токсичными свойствами. Последние связаны с образованием термолабильных токсических субстанций белковой природы, неотделимых от тела микроорганизмов (видоспецифический антиген). Антигенная структура риккетсий Провачека отличается от других риккетсий (Ку-лихорадки, цуцугамунии, клещевой пятнистой лихорадки) и сходна с риккетсиями Музера благодаря наличию общего термостабильного антигена. Риккетсии Провачека малоустойчивы к нагреванию и действию дезинфицирующих веществ в обычных концентрациях. Значительно большую устойчивость они обнаруживают к действию низких температур и высушиванию. Так, в сухих фекалиях зараженных вшей они сохраняют жизнеспособность при комнатной температуре до 4 мес, а в леднике – до года.

2. Лабораторная диагностика сыпного тифа

Лабораторная диагностика сыпного тифа – бактериологический метод не применяется в связи с его трудностями. Ведущая роль принадлежит серологическим методам исследования.

Чувствительными серологическими реакциями со специфическим риккетсиозным антигеном являются:

реакция агглютинаций риккетсий (РАР),

реакция связывания комплемента (РСК),

реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

В связи с тем, что у некоторых больных бывает положительной лишь одна из серологических проб, необходимо параллельно изучать ряд серологических тестов, обычно РСК и РНГА. Диагностические титры РСК 1:640 и 1:1280 на 12—20-й день болезни.

У реконвалесцентов сыпного тифа комплементсвязывающие антитела сохраняются в течение многих лет, что делает РСК пригодной для ретроспективной диагностики болезни (в титре 1:10). Наибольшую ценность для серодиагностики сыпного тифа имеет РНГА, позволяющая выявить не только суммарный титр антител, но и принадлежность их к классам иммуноглобулинов. При сыпном тифе с 5—7-го дня болезни выявляются антитела, принадлежащие к классу М(IgM), в диагностическом титре 1:1000 и более.

Максимальный титр антител определяется с 15—20-го дня болезни (1:12 800 и более), при этом с 3—4-й недели болезни в сыворотке крови преобладают антитела класса Джи (IgG). У больных болезнью Брила с первых дней болезни и в более высоких цифрах (РСК 1:10 240) и более, РНГА 1:64 000 и более) выявляются антитела принадлежащие классу IgG.

Кожная аллергическая проба с антигеном риккетсий Провачека – чувствительный и специфический иммунологический тест для выявления сенсибилизации организма человека после перенесенного заболевания. Эта реакция является ценным и простым методом определения иммунологической структуры населения в отношении сыпного тифа.

Вопрос 63. Возбудитель Ку-лихорадки

1. Морфология, биология и антигенные свойства возбудителя Ку-лиходрадки

Ку-лихорадка – природно-очаговая инфекция с разнообразными механизмами заражения, вызываемая риккетсией Coxiella burnetti с резервуарами возбудителей в природных очагах (гамазовые и аргазовые клещи). Это мелкие, кокковидные, палочковидные формы размером 0,25—1 мкм, мельчайшие формы возбудителя проходят через ультрафитрацию. Отличаются полиморфизмом, способны образовывать эль-формы (L-формы)

Риккетсии Coxiella burnetti являются внутриклеточными паразитами. Культивируются в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов, на культурах тканей, на сывороточном агаре. В отличие от других риккетсий возбудитель Ку-лихорадки не имеет общих антигенов ни с одним из видов протея, обладают фазовой изменчивостью (в РСК антигены I фазы обнаруживаются в период реконвалесценции, а II фазы в ранний период болезни).

Из лабораторных животных наиболее чувствительны к риккетсиям Coxiella burnetti морские свинки. После заражения у них развивается генерерализованная инфекция с поражением внутренних органов.

Риккетсии Coxiella burnetti отличаются относительно высокой устойчивостью к ультрафиолетовым лучам. В водопроводной воде они остаются жизнеспособными до 160 дней, в молоке – 125 дней, масле – 40 дней, мясе – 30 дней. В сухих фекалиях инфицированных клещей риккетсии сохраняют жизнеспособность до 1,5 лет, в сухих фекалиях и моче пораженных животных – до нескольких недель, в шерсти животных до 9—12 мес. Погибают при кипячении более 10 мин. Риккетсии устойчивы к ультрафиолетовому облучению, к воздействию формалина, фенола, хлорной извести и других дезинфекторов в обычных рабочих концентрациях.

2. Лабораторная диагностика. Бактериологическое исследование

Бактериологический метод основан на выделении культуры возбудителя из крови, мокроты, ликвора, грудного молока или мочи больных с использованием тканевых сред. Для постановки биологической пробы используются морских свинок, белых мышей и крыс. У морских свинок через 7 дней после заражения развивается лихорадка.

Риккетсии Coxiella burnetti в большом количестве накапливаются в печени, селезенки и других органах. Иногда у морских свинок после заражения бывает бессимптомное течение инфекции, что заставляет прибегать к постановке серологических реакций с целью окончательной диагностики. Специфичность инфекции удается доказать иногда только через нескольких пассажей. Чистые культуры выделяют путем введения в желточный мешок куриных эмбрионов исследуемого материала.

3. Серологическая диагностика

Серологическая диагностика – наиболее проста, доступна и не менее надежна. Наиболее часто применяют реакцию связывания комплемента и реакцию агглютинации. В РСК с антигеном диагностический титр 1:8–1:16 выявляется с 10—12-го дня болезни (с антигеном II фазы) и достигает максимального значения на 3—4-й неделе болезни (с антигеном I фазы). Комплементсвязывающие антитела в низких титрах выявляются у реконвалесцентов в течение ряда лет.

Надежным методом диагностики является иммунолюминисцентный метод исследования.

Для непосредственной и ретроспективной диагностики Ку-лихорадки предложена внутрикожная проба. Трудности приготовления стандартного антигена лишают ее практической ценности, хотя при эпидемиологических и эпизоотологических обследованиях эта проба могла бы быть полезной.

Для выявления природных очагов Ку-лихорадки важны массовые исследования клещей и диких животных на возбудителя. Методом флюоресцирующих антител исследуются гемолимфа и кишечник клещей, препараты-отпечатки внутренних органов животных на зараженность риккетсиями Coxiella burnetti.

Вопрос 64. Возбудитель чумы

1. Морфология возбудителя чумы

Чума относится к особо опасным инфекциям и является типичным зоонозом с природной очаговостью. Грызуны (суслики, сурки, мыши, крысы) являются резервуаром инфекции в природе и передают ее один другому главным образом через блох. От больных грызунов, также через блох, может заразиться человек, что ведет в дальнейшем к вспышкам чумы среди людей.

Морфология. Возбудитель – Yersinia pestis относится к роду иерсиниа, семейству энтеробактерий. Представляет собой неподвижную, закругленную на конце овоидную палочку размерами (1,5–2) на (0,5–0,7) мкм. Описан полиморфизм возбудителей чумы с появлением удлиненных зернистых, нитевидных и фильтрующихся форм.

Возбудитель чумы не образует спор, имеет капсулу, грамотрицателен, легко окрашивается анилиновыми красителями (более интенсивно на концах – биполярное окрашивание). В мазках из бульона бактерии чумы располагаются цепочками различной длины обычно с хорошо выраженной биполярностью. На агаре с 3 % поваренной соли можно обнаружить причудливые формы.

Микроб чумы при культивировании на искусственных питательных средах в условиях повышенной температуры (37 °C) образует капсулы. Капсула лучше образуется на влажных и слегка кислых питательных средах. Жгутики отсутствуют.

2. Устойчивость возбудителя чумы

Устойчивость возбудителя чумы вне организма к воздействию факторов среды неравнозначна. Понижение температуры увеличивает сроки выживания бактерий, на пищевых продуктах и предметах обихода они сохраняются до 3 мес, в гное бубонов – 40 дней, в крови и мокроте – 1 мес и более. При температуре 55 °C они погибают через 10–15 мин, при 100 °C – спустя несколько секунд. Обычные дезинфекционные средства в рабочих концентрациях (сулема 1:1000, 3–5 % раствор лизола, 3 % раствор карболовой кислоты, 10 % раствор известкового молока), антибиотики (стрептомицин, тетрациклин, левомицетин) оказывают губительное действие на палочку чумы. Бактерии чумы образуют эндо– и экзотоксин, содержат до 20 антигенов.

3. Биология, культуральные свойства

Культуральные свойства – возбудитель чумы факультативный анаэроб. Хорошо растет на обычных жидких и питательных средах (мясопептонный агар, бульон) при температуре 25–30 °C. Для стимуляции роста микроба чумы целесообразно прибавлять в питательную среду сульфит натрия, гемолизированную кровь, которые синтезируют дыхательные ферменты. На агаровых пластинах рост микроба чумы уже через 24 часа заметен в виде нежного сероватого налета.

Колонии на агаре соответствуют R форме (вирулентные); начало развития колонии обнаруживается в виде появления очень маленьких рыхлых глыбок и затем плоских слоистых образований с неровными краями, напоминающих кружевной платочек серовато-белого с голубоватым оттенком цвета. Колониям присущ полиморфизм.

На бульоне культура растет в виде хлопьев, взвешенных, в совершенно прозрачной жидкости с рыхлым осадком на дне. Возбудители чумы восстанавливают нитриты в нитраты, ферментируют с образованием пленки глюкозу, левулезу, мальтозу, галактозу, арабинозу, ксилозу и маннит, продуцируют дегидразы и уреазы. Желатин не разжижают, индол и сероводород не образуют.

Вопрос 65. Лабораторная диагностика чумы

1. Забор материала. Микроскопическое исследование

Чума является чрезвычайно контагиозной, поэтому взятие материала от больного (особенно легочной формы) производится с соблюдением мер предосторожности. Работа в очаге проводится в полном противочумном костюме. В лабораторию могут быть доставлены следующие материалы:

содержимое бубона (легочная форма чумы);

отделяемые язвы или пунктет из карбункула (кожная форма чумы);

материал из зева, взятый тампоном и мокрота (легочная форма чумы);

секционный материал (кусочки органов трупа, кровь);

живые грызуны;

трупы грызунов;

блохи грызунов;

вода;

пищевые продукты.

Материал необходимо брать до назначения лечения. Значение микробиологического диагноза огромно, особенно для выявления первых случаев чумы. Предварительный диагноз устанавливают на основании микроскопического исследования материала, окончательный – на основании выделения и идентификации культуры.

Микроскопическое исследование – мазки фиксируют погружением полностью в жидкость Инпифорова на 20 мин. Окраска по Граму обязательна во всех случаях. Одновременно окрашивают мазок метиленовым синим Лефлера, так как этот метод лучше выявляет биполярность.

2. Бактериологическое исследование

Бактериологическое исследование – посевы исследуемого материала производят на агар добавлением стимуляторов роста (кровь, сульфит натрия). При исследовании материала, обильно загрязненного посторонней микрофлорой (загнившие трупы, мокрота) к агару добавляют генциановый фиолетовый 1:100000. В случаях подозрения на наличие бактериофага посевы обрабатывают антифаговой сывороткой. Инкубацию посевов проводят при 28 °C. В положительных случаях через 12 ч появляются колонии в виде характерных «кружевных платочков».

Когда чистая культура выделена путем прямого посева она подлежит идентификации на основании следующих данных:

внешний вид колонии на агаре;

характерный рост на бульоне;

типичная морфология микробов в мазках и отрицательная окраска по Граму;

типичная патологоанатомическая у лабораторных животных при заражении их чистой культурой;

агглютинация со специфической сывороткой;

отношение к специфическому бактериофагу.

Исследование ферментативных свойств, подвижности и т. п., производят лишь в специальных случаях для дифференциального диагноза с родственными видами бактерий. Проба с фагом осуществляется на твердых средах путем нанесения капли фага на свежий посев культуры и на жидких путем добавления в бульонную культуру фага в количестве ¹/₁₀ объема культуры. Окончательное заключение делают на основании изучения комплекса признаков исследуемой культуры. При этом не следует забывать явлении изменчивости.

3. Биологическая проба

Биологическая проба обязательна при исследовании; наиболее чувствительными из лабораторных животных являются морские свинки и белые мыши. Для постановки биологической пробы животных заражают внутрибрюшинно, подкожно или внутрикожно, а в случае загрязнения материала посторонней микрофлорой – втиранием в скарифицированную кожу.

В зависимости от способа заражения и степени чувствительности к возбудителю животные погибают от чумы на 3—9-й день после инфицирования изменения во внутренних органах в виде геморрагического воспаления, кровоизлияния: в мазках-отпечатках из органов – множество чумных микроорганизмов; посевы инфицированных органов и крови дают обильный рост возбудителя.