Текст книги "Медицинская микробиология: конспект лекций для вузов"

3. Реакции ферментации углеводов

Для идентификации чистой культуры дифтерийной палочки и дифференцировки ее от псевдодифтерийной палочки Гормана исследуют биохимические свойства выделенной чистой культуры. Исследование проводится на средах Гисса или на водно-сывороточной среде (20 %-ной лошадиной сыворотке).

Дифтерийная палочка расщепляет только глюкозу – имеет только столбик, дифтероиды ферментируют глюкозу и сахарозу – синий цвет будет у всей среды, ложнодифтерийная палочка не расщепляет сахаров, но разлагает мочевину – вся среда приобретает оранжевый цвет. На основании реакций ферментации углеводов можно также установить два основных биологических типа дифтерийной палочки: гравис и митис. Формулировка окончательного ответа при положительном анализе: «Выделены токсичные (нетоксичные) дифтерийные палочки», в случае изучения культурально-биохимических признаков указывается принадлежность к типу гравис или митис, а при серотипировании культуры указывается серологический тип.

Вопрос 51. Возбудитель коклюша

1. Морфология, биология, культуральные свойства возбудителя коклюша

Возбудитель коклюша – Bordetella pertussis был выделен из мокроты ребенка, больного коклюшем в 1906 г. Борде и Жангу. В 1937 г. был описан микроб от больного коклюшем, сходный, но не идентичный с бактерии пертуссис (коклюша), названный бактерией парапертуссис (паракоклюша).

Морфология: короткая грамотрицательная овоидной формы палочка размером 0,2 на 0,4–1,2 мкм. При окраске толуидиновым синим обнаруживаются биполярно расположенные метахроматические гранулы. У палочки коклюша можно обнаружить также капсулу.

Биология палочки, культуральные свойства: свежевыделенные культуры коклюшных микробов, S-форма, или 1 фаза по Лесли и Гарднеру, растут только на питательной среде, состоящей из картофельно-глицеринового агара с добавлением крови (среда Барде-Жангу).

Колонии палочки коклюша гладкие, блестящие, прозрачные, куполообразные с жемчужным или ртутным оттенком, размером около 1 мм в диаметре. Колонии бактерии паракоклюша по внешнему виду очень похожи на бактерии коклюша, но они более крупные по размерам и появляются раньше, чем коклюшные колонии.

Бактерии коклюша, также как атипичные и паракоклюшные, растут на обычных питательных средах. На полусинтетической среде – казеиново-угольном агаре (КУА) – колонии коклюшных микробов мелкие (0,5–1 мм), выпуклые, четко контурированные, блестящие, гладкие, серовато-кремового цвета и вязкой консистенции.

Колонии коклюшных и паракоклюшных микробов на среде Борде-Жангу окружены характерной зоной гемолиза. (зона не резко отграничена и распространяется диффузно в окружающую среду). Коклюшные микробы не редуцируют сахара, не образуют индола, не редуцируют нитратов и не используют цитратов. Коклюшный микроб факультативный аэроб. Оптимальные условия культивирования 35–36 °C.

Дифференциальными признаками бактерии пертуссис и бактерии парапертуссис служат данные серологических исследований (реакция агглютинации и биохимическая характеристика). Основные отличительные признаки, позволяющие дифференцировать коклюшные и паракоклюшные культуры – паракоклюшные растут при первых пересевах на простом агаре (без крови), на казенново-угольном агаре и мясо—пептонном агаре (особенно с добавлением тирозина), а также на кусочке картофеля, образуя коричневый пигмент, расщепляет мочевину, утилизирует цитраты.

Коклюшный микроб на простом агаре не растет, пигмента не образует и мочевину не расщепляет. Кроме того, антительной сывороткой коклюшные и паракоклюшные возбудители агглютинируются примерно до ¹/₁₀ титра. Также ставят пробу на уреазу – в пробирку с исследуемой культурой добавляют мочевину и фенолфталеин, пробирку встряхивают и ставят в термостат. Реакция (изменение цвета) может наступить через 15–20 мин. Окончательный результат учитывается через 2 ч. Положительная реакция – окрашивание жидкости в малиновый цвет – свойственна культурам паракоклюшных бактерий.

2. Устойчивость к физическим и химическим факторам

Устойчивость к физическим и химическим факторам. Коклюшный микроб – облигатный паразит, вне организма он сохраняется очень недолго. В сухой мокроте – несколько часов; при температуре 50–55 °C погибает в течение 30 мин. Очень чувствителен к ультрафиолетовому свету и химическим антисептикам. Коклюшные и паракоклюшные микробы (в меньшей степени) чувствительны к антибиотикам. Наиболее эффективным из них являются полимиксин, левомицитин, стрептомицин и биомицин.

3. Антигенное строение, патогенность, вирулентность

Антигенное строение. Коклюшный микроб по антигенным свойствам однотипен, но отличается сложностью антигенного строения – у него удается выявить до 12 антигенных компонентов. Коклюшный микроб имеет собственные видовые антигены и общие с паракоклюшными. Общие антигены имеются как у обоих видов (О-антиген), так и отдельные с каждым из них. Из коклюшных микробов были выделены фракции, обладающие иммунологическими свойствами: агглютиноген, гемагглютинин и протективный антиген.

Патогенность, вирулентность, образование токсина. В естественных условиях к коклюшу восприимчив только человек. Наиболее близкая по симптоматике к коклюшу картина заболевания была экспериментально воспроизведена у обезьян.

Куриные эмбрионы, крысы и морские свинки при введении культуры погибают от интоксикации. Внутрикожное введение культуры коклюшных микробов экспериментальным животным вызывают образование некроза в результате освобождения, при разрушении микробных клеток, ее токсичных компонентов.

Вопрос 52. Лабораторная диагностика коклюша

1. Забор и посев материала

Лабораторная диагностика коклюша. Материалом для исследования служит слизь, выделяемая при кашле. В выделениях дыхательного тракта больного коклюшем бактерии могут быть обнаружены посевом во всех стадиях болезни, но особенно в ранний период заболевания. Материал для посева может быть получен двумя способами:

методом «кашлевых пластинок»;

путем забора материала носоглоточным тампоном.

Кашлевые пластинки — в момент появления кашля открытую чашку с питательной средой подносят на расстоянии 8—10 см ко рту ребенка и держат ее так в течение нескольких секунд (6–8 кашлевых толчков). Желательно посев делать на 2 чашки.

После забора материала чашку закрывают как можно быстрее для того, чтобы избежать загрязнения. Чашку помещают в термостат.

Посев носоглоточным тампоном. Стерильный тампон вводят в ноздрю ребенка до задней стенки глотки, где снимают слизь.

Взятие материала тампоном через рот со шпателем более сложная и неприятная для ребенка процедура и не имеет преимуществ перед носоглоточным тампоном. Извлеченным из ноздри тампоном немедленно делают посев на чашки с питательной средой. Посев должен быть сделан в течение 1–2 ч после забора материала.

2. Бактериологическое исследование

Наилучший рост палочка коклюша дает на питательных средах с добавлением большого количества крови. Таковы среды:

картофельно-глицериновый агар с 20–30 % крови по Борде-Жангу;

молочно-кровяной агар;

среда на казеиновом гидролизате с 25 % крови.

Можно пользоваться средой на казеиновом гидролизате и с меньшим количеством крови. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры к питательным средам прибавляют растворы пенициллина, к которому палочка коклюша нечувствительна. Чашки с посевом оставляют в термостате при 37 °C на 2–3 суток. Через 48–72 ч просматривают чашки. При наличии большого количества характерных колоний из них делают мазки, которые окрашивают по Граму, ставят на предметном стекле реакцию агглютинации с антительной сывороткой, разведенной 1:10. Если на чашке появляются единичные колонии, делают пересев в пробирку со скошенной средой. Используют те же питательные среды. Через 24–48 ч роста в термостате исследуют мазки, окрашенные по Граму, и ставят реакцию агглютинации на предметном стекле. Идентификацию микробов коклюша проводят на основании морфологических, биохимических, серологических, токсических и патогенных свойств выделенных культур.

3. Серологические исследования

Серологические исследования – серологическая реакция (агглютинация, связывание комплементы и опсано-фагоцитарная реакция) в некоторой мере помогают подтвердить диагноз при атипичном течении коклюша (появляются антитела со 2—3-й недели заболевания в низких титрах), а также установить его ретроспективно.

В условия массовой иммунизации против коклюша значение этих серологических показателей весьма ограничено.

Для получения агглютинирующей сыворотки применяют иммунизацию кроликов.

Вопрос 53. Возбудитель менингококковой инфекции

1. Морфология менингококка

Возбудитель эпидемического менингита человека – менингококк (Neisseria meningitidis) впервые был открыт в 1887 г. Менингококки могут быть обнаружены в носоглотке человека и вызывают у последнего в ряде случаев рино-фарингит. Особого внимания в патологии человека заслуживают как возбудители воспаления мозговых оболочек (цереброспинальный менингит) и иногда сепсиса.

Морфология менингококка. Менингококки представляют собой грамотрицательные сферические клетки диаметром 0,6–0,8 мкм, Расположенные попарно. Парное расположение выражено особенно ясно при рассмотрении мозгов изготовленных из спинномозговой жидкости. В спинномозговой жидкости менингококки часто располагаются внутриклеточно и имеют форму кофейного зерна. В ряде случаев можно наблюдать их в значительном количестве внеклеточно.

В мазках из культур менингококки располагаются попарно, иногда в виде тетрад. Характерной особенностью менингококков является их полиморфизм. В мазках из свежих культур они имеют вид небольших сферических клеток, в старых (3–5 суток) культурах наряду с небольшими сферическими клетками могут наблюдаться в значительном количестве гигантские клетки этих микробов. Менингококки неподвижны, жгутиков не имеют, спор не образуют.

При изучении культур под электронном микроскопом обнаружена трехслойная клеточная стенка, образованная белками, липидами и липополисаридами, снаружи имеется слой полисахарида, который формирует капсулу.

2. Биология и культуральные свойства менингококка

Менингококки – аэробы, биохимически мало активны, разлагают только глюкозу и мальтозу. Оптимальная температура, при которой наблюдается хороший рост, лежит в пределах 35–37 °C. Менингококки исключительно требовательны к составу питательных сред, размножаются только в присутствии человеческого или животного белка или специального набора аминокислот.

Хорошо растут на таких питательных средах, как среда Леффлера и различные яичные среды. При посеве на плотные питательные среды (сывороточный агар) через 18–24 ч образуются колонии менингококка. Они бесцветны, нежны, имеют диаметр от 0,5 до 1,5 мм, по внешнему виду напоминают колонии шигелл Флекснера. На средах с добавлением крови колонии непрозрачны, беловато-серые и достигают больших размеров. В бульоне рост появляется в виде равномерной мути с нежной пленкой на поверхности.

Устойчивость к физическим и химическим факторам. Устойчивость менингококка к различным физическим и химическим факторам весьма низкая. Менингококки гибнут в течении 5 мин и даже быстрее при температуре 55 °C. К низкой температуре они устойчивы. 1 %-ный раствор фенола или 0,1 %-ный раствор сулемы убивают менингококков в течении 1–2 мин, очень чувствительны они ко всем дезинфектантам. Прямой солнечный свет убивает менингококки за 2–8 ч, под действием ультрафиолетовых лучей возбудитель погибает практически мгновенно.

3. Антигенное строение, серотипы

Возбудители экзотоксина не образуют, но при гибели микробной клетки высвобождается эндотоксин липополисахаридной природы. По антигенной структуре менингококки подразделяются на ряд серологических групп: A, B, C, D, X, Y, Z и другие. Серологические группы менингококков отличаются друг от друга особенностями антигенной структуры. Менингококки имеют следующие виды антигенов:

представленные белками и полисахаридами;

видовой антиген белковой природы;

группоспецифические, представленные гликопротеидным комплексом;

типоспецифические, белковой природы, позволяющие разграничивать различные серотипы, в основном серологических групп B и C. Менингококковые антигены не являются строго специфичными. Это затрудняет оценку результатов серологического обследования людей при изучении иммунологического к менингококковой инфекции.

Под влиянием сульфаниламидов и антибиотиков проявляется изменчивость менингококков. Изменчивость касается морфологических, гистохимических и антигенных свойств микробов. Особенно лабильными являются антигенные свойства: образование неагглютинирующихся типовыми сыворотками вариантов и штаммов, агглютинирующихся несколькими типовыми сыворотками. Установлена способность менингококка к образованию таких измененных вариантов, как L-формы, формы гетероморфного роста.

L-формы могут быть стабильными и нестабильными, они обладают значительной резистентностью к пенициллину. L-формы являются одним из причинных факторов затяжного течения менингококковых менингитов.

Вопрос 54. Лабораторная диагностика менингококковой инфекции

1. Забор материала

Для исследования берут:

слизь из носоглотки,

спинномозговую жидкость,

розеолы при менингококковом сепсисе,

кровь,

у умерших исследуют гной из спинномозговых оболочек и материал из воспалительных органов.

Спинномозговая жидкость берется при люмбальной пункции в три пробирки. Спинномозговая жидкость исследуется в лаборатории с помощью:

общего анализа (реакция Панди, количество белка и цитоз),

биохимического анализа (определение сахара и хлоридов);

бактериологического анализа.

Пробирка со спинномозговой может сохраняться в течение нескольких часов в термостате при температуре 37 °C.

Макроскопически жидкость при менингококковом менингите может быть слегка мутноватой, мутной, гнойной, густой с желтоватым или зеленоватым оттенком. В клеточном составе преобладают нейтрофилы, общее количество белка повышенно от 0,66 до 3–8 % и более. Содержание сахара и хлоридов несколько снижается.

2. Бактериоскопический и бактериологический методы исследования

Наиболее ранним простым методом исследования является бактериоскопия мазка спинномозговой жидкости. Для этого из осадка приготовляется мазок, фиксируется, окрашивается метиленовой синькой или по Граму. Обнаружение внутри и внеклеточно расположенных грамотрицательных диплококков, имеющих типичную морфологию, является важным диагностическим признаком. Бактериоскопическим анализом диагноз подтверждается в 50–70 % случаев. Выделение чистой культуры менингококка из ликвора более достоверно, но занимает 3–4 дня. Предварительный ответ может быть получен через сутки.

Бактериологический метод по частоте обнаружения возбудителя уступает бактериоскопическому. При одновременном использовании обоих методов частота подтверждения диагноза достигает 70 %. Отрицательные результаты бактериологического исследования не исключают менингококковой природы заболевания.

П. П. Чибирас предложена бактериоскопия мазков крови или толстой капли крови в целях обнаружения менингококка. Метод прост и высоко результативен, является экспресс-методом. Мазки крови окрашиваются после фиксации по Романовскому-Гимзе, а препараты толстой капли – без фиксации 1 %-ным водным раствором метиленовой синьки в течение двух минут. В мазках крови почти в каждом поле зрения удается обнаружить 5—20 менингококков, фагоцитированных нейтрофильными лейкоцитами. Аналогичным методом предлагается исследовать спинномозговую жидкость.

Серологические методы диагностики последнее время не нашли широкого применения в силу малой результативности.

Из иммулогичесих методов наиболее чувствительны и информативны реакция непрямой гемагглютинации и иммуноферментный метод.

Вопрос 55. Возбудитель стрептококковой инфекции

1. Стрептококковые инфекции

Стрептококки (Streptococcus) – возбудители большого числа инфекций человека и животных, они вызывают рожистое воспаление, сепсис и гнойные инфекции, скарлатину, ангину. Имеются непатогенные разновидности, обитающие в полости рта и кишечника человека. Анаэробные штаммы стрептококков обладают незначительной степенью активности и их обнаруживают обычно в полости рта и пищеварительном тракте человека. В некоторых случаях они вызывают хронические воспалительные процессы и являются возбудителями раневых инфекций. Значительно большее значение в патогенезе стрептококковых инфекций человека имеют факультативные анаэробы, которые разделены по характеру гемолиза на агаре с кровью на 4 типа:

бута-гемолитичекие стрептококки,

альфа-гемолитичекие стрептококки,

гамма-гемолитичекие стрептококки не вызывающие видимого гемолиза на твердых питательных средах с кровью.

Наибольшей патогенностью обладает B-гемолитические стрептококки, которые являются возбудителями большинства стрептококковых инфекций у человека. Патогенность стрептококков типа А менее выражена. Обнаруживаются они в слизи зева здоровых людей, но в некоторых случаях и при хрониосепсисе, подостром септическом эндокардите, инфекциях полости рта. Гамма-гемолитические стрептококки – сапрофиты верхних дыхательных путей и кишечного тракта человека. В некоторых случаях они вызывают подострый септический эндокардит, инфекции мочевых путей, раневые инфекции.

2. Морфология, биология стрептококка

Морфология стрептококков – это неподвижные шаровидные или овальные кокки диаметром 0,8–1 мкм, образующие цепочки различной длины и положительно окрашиваются по Граму. Часть штаммов образует капсулу. Длина цепочек связана с условиями выращивания. В жидкой питательной среде они длиннее, на плотных средах нередко расположены в виде коротких цепей и пучков. Кокки перед делением могут быть овоидными. Деление происходит перпендикулярно по отношению к цепи. Каждый кокк делится на 2.

Биология стрептококков: культуральные свойства. На агаре с кровью стрептококк образует мелкие (1–2 мм в диаметре) полупрозрачные палочки, сероватые или бесцветные, которые хорошо снимаются петлей. Величина зоны гемолиза варьирует у разных штаммов: группа А образует зону гемолиза несколько превышающую диаметр колонии, группа B дают большую зону гемолиза. Стрептококки типа А образуют зеленоватую или зеленовато-коричневую зону гемолиза, мутноватую или прозрачную, варьирующую по величине и интенсивности окраски. В некоторых случая сама колония приобретает зеленоватое окрашивание. В жидких питательных средах для стрептококков характерен придонный часто поднимающийся по стенкам рост. При взбалтывании зернистая или хлопьевидная взвесь. Общепринятые среды для выращивания: мясопептонный агар с добавлением крови кролика или барана, полужидкий агар с сывороткой.

Хороший рост и токсинообразование могут быть обеспечены на «комбинированном бульоне» или на средах, содержащих казеиновый гидролизат и дрожжевой экстракт. Гемолитические стрептококки метаболизируют глюкозу с образованием молочной и других кислот, что является фактором, лимитирующим рост микробов в питательной среде. Устойчивость к физическим химическим факторам.

Гемолитические стрептококки группы А в течении длительного времени могут сохраняться на предметах, в пыли в высушенном состоянии. Однако эти культуры, сохраняя жизнеспособность, утрачивают вирулентность.

Стрептококк группы А высокочувствителен к пенициллину, который оказывает на него бактерицидное действие. Сульфаниламид действует на стрептококк А бактериостатически.

3. Антигенное строение; классификация

Современная классификация стрептококков основана на их серологических различиях. Известно 17 серологических групп: A, B, C, D, E, F и т. д. Деление на группы основано на наличии у представителей разных групп специфического полисахарида (субстанция С). Патогенны для человека стрептококки группы А. Стрептококки разных групп не только отличаются по способности вызывать заболевания у человека и животных и по своему природному обитанию, но и по биохимическим и культуральным особенностям.

Кроме серологических различий, при дифференциации штаммов учитывают следующие показания:

источник выделения,

характер гемолиза,

способность к образованию растворимого гемолиза,

резистентность к различным температурам,

особенность расти в молоке с метиленовым синим,

ферментацию сахаров,

разжижение желатины.

Серологические серотипы – методом агглютинации на стекле штаммы бетта-гемолитического стрептококка, выделенного при скарлатине и других стрептококковых инфекциях и от здоровых носителей были разделены на 50 серологических типов. Культуры 46 типов отнесены к группе А, типы 7, 20, 21 – к группе С и тип 16 – группе Г.

Деление стрептококков на типы производится и с помощью реакции преципитации. Результаты определения типа по реакции агглютинации и в реакции преципитации обычно дают совпадающие результаты. При скарлатине обычно преобладает один или 2–3 типа (так называемые типы). Обнаружены общие антигенные субстанции в штаммах, принадлежащих к группе А, С, Q.

В стрептококковом (при скарлатине) токсине содержатся две фракции:

термолабильная или истинный скарлатинозный токсин;

термостатическая, которая обладает свойствами аллергена.

Истинный эритрогенный токсин является протенном. Это экзотоксин стрептококка, который вызывает реакцию Дика у восприимчевых к скарлатине. Очищенный эриторгенный токсин применяют для кожных проб с целью определения уровня антитоксического иммунитета (реакция Дика).