Текст книги "Медицинская паразитология с энтомологией"

Мазки-препараты готовят из гноя, мокроты, фекалий больных, колоний или налета чистых культур протистов, выросших на питательных средах в чашках Петри или пробирках. Мазки делают на предметных стеклах, как правило, бактериальной петлей (диаметр 3x2 мм) из нихромовой проволоки, конец которой укрепляют зажимом в специальном петледержателе или впаивают в стеклянную палочку Кроме того, для изготовления мазков необходимы газовая горелка или спиртовка, ванночка с подставкой (мостик) для стекол, промывалка с водой, флакон с изотоническим раствором хлористого натрия, красители, фильтровальная бумага, банки с дезинфицирующим раствором для обезвреживания отработанных препаратов, пипеток, материалов и рабочего стола.

Этапы приготовления мазка. 1. Исследуемые материалы и культуры простейших берут бактериальной петлей, которую стерилизуют в пламени горелки. При ее введении в пробирки и колбы стерилизуют не только петлю, но также верхнюю часть петледержателя. При этом пробирку с культурой берут большим и указательным пальцами левой руки, а бактериальную петлю держат правой, как ручку. Ватную пробку зажимают мизинцем правой руки и извлекают из пробирки. Края горлышка пробирки стерилизуют в пламени горелки и почти одновременно обжигают петлю, которую быстро вводят внутрь пробирки, охлаждают и прикасаются к налету на скошенном питательном агаре или же погружают ее в жидкую питательную среду. Затем петлю извлекают, быстро обжигают край пробирки, закрывают пробкой, проведенной через пламя, и ставят в штатив.

2. Налет чистой культуры простейших или колонию эмульгируют в капле воды на предметном стекле и круговыми движениями петли равномерно распределяют на площади диаметром 1,0–1,5 см. Точно такого же размера готовят мазок из бульонной культуры, гноя, мокроты, других материалов, которые, естественно, не взвешиваются в воде. Хорошо приготовленные тонкие мазки имеют округлую форму, быстро высыхают при комнатной температуре, более толстые – высушивают в термостате или при подогревании над пламенем горелки, не допуская свертывания белка простейших и гельминтов, нарушающего их структуру.

3. Высушенные мазки фиксируют 5–6 с в пламени спиртовки, чтобы убить протистов для лучшего восприятия ими красителей, закрепить их на предметном стекле и предотвратить их смыв при ополаскивании мазка водой после окраски.

Для приготовления мазков из гноя и мокроты пользуются двумя предметными стеклами (рис. 1). На середину одного из них наносят небольшое количество материала, который покрывают вторым стеклом так, чтобы осталась свободной треть первого и второго стекол. Раздвигая стекла в стороны, получают два больших мазка одинаковой толщины.

Мазки из крови готовят следующим образом. Стерильной иглой для инъекций делают укол предварительно продезинфицированного безымянного пальца левой руки. Первую каплю крови удаляют ватой, а вторую наносят на край хорошо обезжиренного предметного стекла. Мазки делают узким шлифованным стеклом (рис. 2), установленным под углом 45°, продвигая его вдоль предметного стекла в сторону, не доходя до края (мазок имеет желтоватый цвет и просвечивается).

Препараты-отпечатки из внутренних органов трупов, мяса, колбасных изделий получают, прикасаясь предметным стеклом к поверхности разрезов, выполненных стерильным скальпелем.

Рис. 1. Приготовление мазка из гноя и мокроты

Рис. 2. Техника приготовления мазка из крови (стрелка показывает направление движения шлифованного

Приготовленные таким образом препараты из гноя, мокроты, крови, органов и тканей, деформирующихся при высокой температуре, обрабатывают метиловым спиртом -5 мин, этиловым спиртом -10-15 мин, смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира) – 10–15 мин, ацетоном – 5 мин, парами осмиевой кислоты и формалина -10-20 с.

4. Фиксированные мазки окрашивают кислыми, щелочными и нейтральными анилиновыми красителями.

Наиболее широко при простом (однократном) способе окраски мазков применяются водный фуксин Пфейффера, метиленовый синий Леффлера и генцианвиолет.

Водный фуксин готовится из концентрированного фенолового фуксина Циля (основной фуксин – 1 г; спирт 96 %-ный -10 мл; фенол кристаллический – 5 г; глицерин – несколько капель; вода дестиллированная – 100 мл), разводя его дестиллированной водой в соотношении 1:10. При этом насыщенный кристаллами фенола фуксин Циля растирают в ступке до гомогенной массы, добавляя малыми порциями спирт. Затем, не прекращая помешивания, постепенно доливают 9 частей дистиллированной воды. Через 48 ч выдерживания при комнатной температуре раствор фильтруют, после чего фуксин Пфейффера готов к употреблению.

Метиленовый синий Леффлера готовят путем прибавления к 30 мл насыщенного раствора метиленового синего (10 г метиленового синего в 100 мл 96 %-ного этилового спирта) 1 мл 1 %-ного натрия гидроксида или калия гидроксида и 100 мл дестиллированной воды; везу вин – растворяя 2 г порошка в смеси 60 мл 96 %-ного спирта и 40 мл дистиллированной воды при нагревании до кипения, с последующей фильтрацией.

Для приготовления генцианвиолета берут 1 г красителя и растворяют его в феноловом растворе – 100 мл дестиллированной воды, 2 г кристаллического фенола и 10 мл 96 %-ного этанола.

После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листами фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива оптического микроскопа.

При сложных методах окраски мазков применяют два-три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать протистов и выявлять некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Цилю – Нельсену, Романовскому – Гимзе и некоторые другие.

Мазок для люминесцентной микроскопии готовят обычным образом, фиксируют в ацетоне 5-10 мин и наносят на него флюорохром на 20–30 мин. В качестве флюорохромов используют аурамин, акридин желтый, флюоресцеинизотиоцианат. Готовый препарат 15–20 мин промывают проточной водой, покрывают покровным стеклом и микро скопируют.

Для электронной микроскопии вместо предметных стекол применяются очень тонкие пленки-подложки, незначительно поглощающие электроны. Они крепятся на опорные сетки. Материалом для приготовления пленок служит коллодий, оксид алюминия и кварц. Исследуемый материал, тщательно очищенный от различных примесей, наносят на пленку, на которой после испарения жидкости остается тончайший слой. Высушенный препарат устанавливают для микроскопирования. Контрастирование препаратов осуществляется с помощью электроноплотных (задерживающих электроны) веществ: напыление тяжелыми металлами, обработка препаратов фосфорно-вольфрамовой кислотой и уранилацетатом.

Чистые культуры патогенных протистов выделяют на элективных средах, куриных эмбрионах, культурах человеческих клеток, a Trypanosoma kruzi культивируют в организме «поцелуйных клопов» путем вскармливания их на больных, но эту работу осуществляет хорошо обученный контингент сотрудников специализированных лабораторий и научно-исследовательских институтов.

Физиология протистов

Протесты нуждаются в самых разнообразных питательных веществах, одни из них используются для построения структурных элементов клетки, другие служат источником энергии. Питательные вещества поступают в протесты через оболочку. В процессе питания она играет роль сита. Главное значение в питании имеет цитоплазматическая мембрана. Через нее вещества проникают разными путями: 1) путем простой диффузии низкомолекулярных соединений, образующих истинные растворы; 2) путем облегченной диффузии, которая осуществляется с помощью белков-переносчиков, или байдинг-белков; 3) путем активного транспорта веществ при участии пермеаз.

Для нормальной жизнедеятельности протистов, как и для бактерий, необходимы: углерод, азот, водород и кислород, который они чаще всего получают из минеральных соединений. В их метаболизме используется сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо и другие зольные элементы.

Для активации роста протистов им необходимы в микродозах бор, молибден, цинк, кобальт, никель, марганец, медь, йод, бром. Некоторым видам требуются аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и витамины как ростовые вещества.

Источниками биогенов, других элементов, ростовых веществ для выращивания протистов являются мясо, рыба, овощи, органические добавки. В зависимости от свойств и назначения различают жидкие, полужидкие и плотные среды; натуральные, синтетические и полусинтетические; простые (основные), сложные и специальные.

Жидкие питательные среды готовят на водопроводной и дистиллированной воде. Для их уплотнения используют агар-агар (от 0,15 до 3 %), диоксид кремния, или силикагель (1,5 %) и желатин (10–15 %). При этом агар-агар получают специальной обработкой морских водорослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота. Студень, образуемый агаром, плавится при температуре 70-100 °C и застывает при комнатной температуре. Силикагель является продуктом прокаливания геля поликремниевой кислоты. Желатин представляет собой вещество белковой природы. Его готовят из костей, хрящей и отходов шкур телят.

Натуральные среды состоят из белковых продуктов животного, растительного и микробного происхождения. Химический состав их непостоянен и может в значительной степени варьировать.

К простым натуральным питательным средам относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), молоко и овощи, например кусочки картофеля, свеклы, моркови.

Основой для приготовления МПБ и МПА служит мясная вода. Готовят ее следующим образом. Свежую говядину или телятину, отделенную от костей, жира и сухожилий (500 г), пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 л водопроводной воды, хорошо размешивают и оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °C. Далее настой мясного фарша отжимают через марлю, кипятят в течение 5 мин для свертывания белков, пропускают через ватный фильтр, доливают до первоначального объема водой и после разлива в колбы и флаконы стерилизуют в автоклаве. Содержащая определенное количество аминокислот, витаминов группы В, солей, углеводов, факторов роста, прочих экстрактивных веществ мясная вода после автоклавирования должна иметь вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (pH 6,2–6,4).

Для приготовления МПБ к мясной воде прибавляют 1 % сухого пептона (смесь альбумоз, полипептидов и аминокислот), 0,5 % натрия хлорида и, устанавливая нужный уровень pH среды (для бактерий-нейтрофилов – 7,2–7,6, для алкалифилов -7,8–8,6, для ацидофилов – 4,0–6,0), кипятят 30 мин, фильтруют и стерилизуют в автоклаве.

МПА готовят на бульоне, прибавляя хорошо промытый агар-агар, который после расплавления и охлаждения придает среде плотную (1,5–3 %) или полужидкую (0,15-0,4 %) консистенцию студня (геля).

В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметично закрытых банках. Готовят эти среды по указанным на этикетках прописям. Навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллированной воды, среду разливают в соответствующую посуду и стерилизуют. Преимуществом сухих производственных сред является постоянство их состава, стандартность, удобство в приготовлении, легкость транспортировки.

Молоко как простая среда становится пригодным для выращивания бактерий лишь после снятия сливок, для чего требуется отстаивать его в холодильнике, а овощи – после очищения от кожуры и получения сочных ломтиков.

Сложные питательные среды готовят на основе МПБ или МПА, добавляя к ним углеводы, сыворотку, молоко, дефибринированную кровь животных и человека, асцитическую жидкость брюшной полости больных. Среди них выделяют специальные среды, которые по своему назначению делят на селективные (элективные) и дифференциально-диагностические.

Синтетические среды создаются из химически чистых соединений в строго определенных концентрациях в зависимости от потребностей микроорганизмов в факторах роста. Готовят их на основе минимальных сред.

Важным показателем пригодности среды является ее pH, которая для большинства патогенных микробов соответствует 7,2–7,4.

По температурному оптимуму роста бактерии подразделяют на психро– (15–20 °C), термо– (50–60 °C) и мезофилы (30–37 °C). Болезнетворные виды микробов в большинстве своем – мезофилы.

Вырастая на поверхности плотных питательных сред, отдельные особи микробов, а также протесты образуют колонии, представляющие собой однородную популяцию клеток. При этом у разных видов бактерий, грибов и микоплазм колонии неодинаковы по размерам, очертаниям, характеру поверхности, особенностям краев, прозрачности, влажности, консистенции, окраске и пр. При густом засеве плотная среда покрывается сплошным налетом культуры, который называют газоном.

Питательные среды готовят в эмалированной и стеклянной посуде. Новую стеклянную посуду для нейтрализации растворимой щелочи кипятят в 1–2 %-ном растворе соляной кислоты, а бывшую в употреблении – моют в мыльном или содовом растворе. Ту и другую прополаскивают, тщательно промывают в проточной воде и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки заливают питательными средами, закрывают ватными тампонами (пробками) и стерилизуют.

Существует несколько способов посева, но каждый из них может отличаться некоторыми техническими особенностями, зависящими от инструмента засева, консистенции питательной среды, посуды, в которой она находится, характера засеваемого вида протесты, материала, в котором он содержится. При этом засев производят бактериальной петлей или иглой, микробиологическим шпателем, градуированной пипеткой. К основным из них относятся посевы бактериальной петлей и шпателем.

Посев бактериальной петлей на скошенную и жидкую среды в пробирках. Приступая к засеву, в левой руке размещают две пробирки, например с чистой культурой бактерий и со стерильной средой, держа их в наклонном положении так, чтобы не проливалось имеющееся в них содержимое. В правую руку, как пишущую ручку, берут петлю и в вертикальном положении фламбируют в пламени горелки. Пробки из пробирок вынимают одновременно, зажав их между мизинцем и ладонью правой руки, тотчас же обжигают края горлышек пробирок. Прокаленную петлю вводят в пробирку, охлаждают, прикасаются к культуре и быстро переносят ее в пробирку со средой, ополаскивая петлю в бульоне или распределяя штрихами по скошенной поверхности агара. Петлю извлекают, фламбируют края пробирок и закрывают их проведенными через пламя пробками, затем петлю стерилизуют, пробирки надписывают и ставят в штатив.

Посев уколом в столбики полутвердых сред. Обычно засевают полутвердые столбики МПА и желатина, насквозь прокалывая их иглой или петлей, при этом пробирки держат дном вверх. Посев применяют для выращивания бактерий-анаэробов, хранения культур, выявления ферментативных свойств.

Посев пипетками. Пробирку (колбу), содержащую жидкую среду, держат левой рукой под небольшим углом, а градуированную пипетку с материалом под таким же наклоном, но в обратном положении – в правой. Переносят его в питательную среду после снятия пробки и фламбирования горлышка пробирки, погружая кончик пипетки до дна. Материал выдувают и тщательно перемешивают в среде. Пробирки закрывают, а пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.

Приготовленные впрок плотные питательные среды, например МПА, расплавляют и, остудив их до 50–60 °C, берут флакон в правую руку, а левой вынимают пробку, обжигая горлышко. Большим и указательным пальцами левой руки приподнимают крышку чашки Петри и, не касаясь ее краев, вводят под нее горлышко, выливая 15–20 мл среды. Быстро закрывают крышку и флакон. Чашку слегка покачивают для равномерного распределения среды и оставляют на столе для застывания. Затем переносят ее в термостат, переворачивают вверх дном, снимают крышку и в таком положении 15–20 мин подсушивают в термостате.

Посев бактериальной петлей. Исследуемый жидкий материал набирают петлей и, не прикасаясь к стенке пробирки, встряхивают для удаления излишка. Чашку Петри с агаризованной средой помещают на столе вверх дном. Донную часть чашки берут левой рукой и держат почти вертикально, петледержатель – большим и указательным пальцами правой руки; легкими движениями наносят оставшуюся часть материала параллельными штрихами по всему диаметру поверхности среды.

Посев шпателем. Шпатели готовят из стеклянных палочек толщиной 4–5 мм, согнутых в виде треугольника. Стерилизуют их завернутыми в бумагу в сухожаровом шкафу, а также сжиганием спирта после предварительного их смачивания. Засевают шпателем каплю материала или взвеси микробов, распределяя ее круговыми движениями по всей поверхности питательной среды и удерживая левой рукой крышку чашки Петри в приоткрытом положении. Одним шпателем тем же приемом засеваются поочередно вторая и третья чашки, после чего его погружают в банку с дезинфицирующим раствором. Чашки переворачивают, надписывают и ставят в термостат вверх дном, чтобы избежать размывания растущих колоний на среде капельками конденсационной воды, которые скапливаются на внутренней поверхности крышки при обычном ее положении.

Патологическими материалами, которые используются для посева на питательные среды, могут быть кровь, спинномозговая жидкость, пунктаты (от лат. punctum – прокалывать), например полостей и лимфоузлов (секреты), рвотные массы, промывные воды желудка, моча, испражнения, гной, слизь, мокрота (экскреты). Эти и другие материалы берутся стерильными инструментами и помещаются в стерильные банки, флаконы, пробирки и направляются на исследование.

В сопроводительном листе, прилагаемом к пробам, должны быть указаны фамилия, инициалы больного или умершего, материал, цель исследования, название направляющего пробы учреждения, адрес лаборатории, куда они доставляются, и дата.

При микробиологическом исследовании материалов нужно строго соблюдать правила противоэпидемического режима, исключающие возможность внутрилабораторного инфицирования, и, прежде всего, неукоснительно выполнять рекомендации по предотвращению заражения вирусами гепатитов и СПИДом.

Чистая культура – это биомасса одинаковых особей микроорганизмов (колонии), полученных на питательной среде из патологического материала, глубокое исследование которой позволяет установить видовую принадлежность возбудителя и природу инфекционного заболевания.

Приступая к выделению чистой культуры, следует иметь в виду, что возбудители в экскретах находятся в ассоциации с банальной (посторонней) микрофлорой. Для их изоляции гной,

мокроту, осадок мочи, испражнения необходимо засеять так, чтобы получить изолированные колонии. С этой целью они засеваются частыми штрихами бактериальной петлей по всей поверхности агаризованных сред в чашках Петри. Взятые тампонами слизь из зева, смывы с рук и предметов засевают на пластинчатые среды круговыми движениями или тампоны вначале отжимают в жидких средах с последующим штриховым отсевом бактериальной петлей.

Выросшие колонии после детального изучения пересевают на скошенные и жидкие среды. Накопив в них биомассу чистой культуры, на I этапе идентификации вида исследуют ее морфолого-культуральные свойства.

Окончательное определение видовой принадлежности выделенной культуры осуществляют на II этапе идентификации после всестороннего исследования: 1) спектра ферментов; 2) антигенной и генотипической структуры микроорганизмов с помощью диагностических иммунных сывороток, ДНК-зондирования и полимеразной цепной реакции.

Иммунологические сдвиги при протозойных инвазиях

Патогенные протесты имеют сложную антигенную структуру и содержат гораздо больший набор антигенов, чем бактерии. Организм больного человека реагирует на антигены протестов развитием разнообразных гуморальных и клеточных защитных реакций, но эффективность их при разных инвазиях неодинакова, что зависит от вида и локализации паразита в организме.

Так, при паразитемиях (развитие простейших в крови) вырабатывается большое количество паразитоцидных иммуноглобулинов, однако полной элиминации циркулирующих в крови простейших они не вызывают. Под их влиянием у части простейших быстро развивается изменчивость антигенной структуры. К таким паразитам, например, можно отнести африканские трипаносомы и малярийные плазмодии. Дизентерийные амебы, жиардии, трихомонады – слабые иммуногены. В ответ на их воздействие организм продуцирует невысокий титр антител. Столь же ограничена индукция клеточных иммунных реакций.

Паразитирующие в спинномозговой жидкости и головном мозге простейшие и гельминты иммунологических реакций не вызывают. Более того, такая локализация защищает их от паразитоцидного действия иммуноглобулинов, фагоцитов и цитотоксических лимфоцитов.

При протозойных инвазиях и гельминтозах могут быть использованы все иммунологические реакции, но чаще всего, – реакция иммунофлюоресценции, реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации и иммуноферментный анализ, которые, однако, часто оказываются недостаточно специфичными вследствие медленного нарастания антипротозойных и антигельминтных иммуноглобулинов или низкого их титра. В отличие от этого при паразитарных болезнях в крови закономерно нарастает титр аллергических иммуноглобулинов.