Текст книги "Медицинская паразитология с энтомологией"

Мечеными называются антитела, связанные с индифферентными для них веществами, которые, не изменяя их специфичности и антигенной структуры, придают иммуноглобулинам характерные свойства, что облегчает идентификацию антигенов в иммунных комплексах.

Наибольшее распространение как «метки» получили: 1) флюорохромы, в частности флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) – в реакциях иммунофлюоресценции (РИФ) и антикомплементарной РИФ; 2) железосодержащий белок ферритин – в иммуноэлектронной микроскопии вирусов и бактерий (иммуноферритиновая реакция); 3) ферменты (чаще перокси-даза) – для проведения иммуноферментного анализа (ИФА); 4) радиоактивные изотопы (¹²⁵J) – для радиоиммунного анализа (РИА). Надо отметить, что в этих реакциях вместо антител метятся также антигены (рис. 8).

Рис. 8. Серологические реакции с использованием меченых антител: Аг – антиген; Ig – иммунная сыворотка

Серологические реакции с использованием меченых антител прочно вошли в практику экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций, широко применяются в идентификации и дифференциации антигенов микробного, животного и растительного происхождения.

Имеются два варианта постановки РИФ (реакции Кунса) – прямая и непрямая реакции иммунофлюоресценции.

Прямая РИФ – простая одноэтапная реакция, но так как для ее выполнения требуется наличие большого количества меченных антимикробных сывороток, то ставится она реже непрямой, постановка которой обеспечивается одной меченной антисывороткой.

Рис. 9. Реакция иммунофлюоресценции: а – прямая; б – непрямая

Непрямая РИФ – двухэтапная реакция, в которой антиген вначале связывают немеченной видовой сывороткой, а затем образованный иммунный комплекс антиген – антитело обрабатывают меченной ФИТЦ антисывороткой, содержащей антитела против иммуноглобулина этого комплекса. Обычно на I этапе ее постановки в качестве видовой сыворотки используют иммунную кроличью сыворотку, полученную путем иммунизации животных соответствующим микроорганизмом, а на II этапе меченную ФИТЦ антикроличью сыворотку ослов или других животных, иммунизированных гамма-глобулинами кролика (рис. 9).

Постановка прямой РИФ. На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки-отпечатки. Препараты высушивают, фиксируют, наносят на них люминесцирующую сыворотку, взятую в рабочем разведении, и помещают во влажную камеру при температуре 37 °C на 20–30 мин (на 25^0 мин – при комнатной температуре). Затем для удаления избытка флюоресцирующих антител препарат промывают в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия в течение 10–15 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной или проточной воде в течение 10 мин. Сушат при комнатной температуре и исследуют под люминесцентным микроскопом с использованием масляной иммерсионной системы.

Рис. 10. Антикомплементарная реакция иммунофлюоресценции:1 – антитело; 2 – антиген; 3 – комплемент; 4 – антикомплементарная сыворотка, меченная ФИТЦ

Для оценки интенсивности специфической флюоресценции бактериальных клеток используется четырехплюсовая шкала: «++++», «+++» – очень яркая и яркая; «++», «+» – выраженная и слабая ободочная зеленая флюоресценция клеток. Обязательными являются три контроля: 1) обработка флюоресцирующими антителами гомологичных бактерий (положительный контроль); 2) гетерологичной культуры (отрицательный контроль); 3) незараженного материала (отрицательный контроль).

Антикомплементарная РИФ. Реакция является модификацией РСК, индикаторной системой в которой служат антикомплементарные антитела, меченные ФИТЦ (рис. 10).

Непрямая антикомплементарная РИФ ставится следующим образом: препарат-антиген готовится на предметном стекле, как для РИФ, но на I этапе обрабатывается не одной иммунной сывороткой, а ее смесью с комплементом морской свинки, а на II этапе – антисывороткой, содержащей меченные ФИТЦ антитела к комплементу. Широкое использование антикомплементарной РИФ ограничено трудностью получения антикомплементарных антител и способа их «метки».

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на обнаружении иммунного комплекса, один из компонентов которого (антитело или антиген) мечен ферментом, способным разлагать субстрат (хромоген) с образованием окрашенных продуктов.

В настоящее время применяется только твердофазная модификация ИФА, пользуясь которой антитела или антигены сорбируются в лунках полистироловых планшетов (на твердой фазе). В большинстве случаев к твердой фазе присоединяются антитела, которые при инкубации с материалом улавливают специфический антиген в ближайшие 30 мин. К образовавшемуся при этом иммунному комплексу затем еще на 30 мин прибавляются меченные пероксидазой антитела, специфические то ли к его антигену, то ли к его антителу.

В итоге образуется иммунопероксидазный тройной комплекс, при добавлении к которому ортофенилендиамина с Н₂0₂ как хромогенного субстрата для пероксидазы через 10 мин происходит пожелтение. Результаты твердофазной модификации ИФА учитываются с помощью специального спектрофотометра.

Иммуноблотинг. В основе иммуноблотинга (blot – пятно) лежит идентификация антигенов и антител на пленке-носителе с помощью ИФА. Его используют, например, в диагностике ВИЧ-инфекции, разделяя белки вируса иммунодефицита человека методом электрофореза в полиакриловом геле. Вслед за этим на полосы преципитата в геле накладывают нитроцеллюлозную пленку и, продолжая электрофорез, переносят белки на нее. Затем пленку смачивают исследуемой сывороткой, а после инкубирования и отмывания от несвязавшихся антител, наносят на нее меченную пероксидазой антисыворотку к Ig человека и ортофенилендиамин как хромогенный субстрат. При образовании комплексов Аг+Ат+антисыворотка на пленке появляются окрашенные пятна.

Для проведения радиоиммунного анализа (РИА) антитела или антигены метят радиоактивными изотопами, и, в зависимости от метода и целей исследования, те или другие сорбируются на твердом носителе. Так, при конкурентном методе РИА в лунках полистироловых планшет сорбируются антитела. Затем к этим иммобилизованным антителам прибавляется исследуемый материал, содержащий специфический к ним антиген. После образования иммунного комплекса добавляют меченный ¹²⁵J антиген, обладающий той же специфичностью к иммобилизованным в лунках антителам.

Внесенный меченый антиген будет реагировать лишь с той частью активных центров иммобилизованных антител, которые остались ^заблокированными антигеном исследуемого материала.

В сравнении с контролем расход меченого антигена будет тем меньше, чем больше заблокированы иммобилизованные антитела, на что укажет радиоактивность жидкой части реагируемой смеси. Для этого, естественно, необходима специальная радиометрическая аппаратура.

Иммуноферритиновая реакция. Иммуноферритиновая реакция применяется чаще всего в вирусологии. Соединяясь с антителами, меченными ферритином, вирусы становятся электронноплотными и легче выявляются при электронной микроскопии.

Аллергия – неадекватный по силе иммунный ответ организма на повторное воздействие вещества-агента (аллергена), связанный с повышенной к нему чувствительностью (гиперчувствительностью) и проявляющийся целым рядом локальных или системных специфических реакций.

Аллергию вызывают многочисленные субстанции, но в основном низкомолекулярные вещества с молекулярной массой 5-15 кД, легко проникающие через слизистые оболочки и быстро связывающиеся с белками организма. По резервуару их образования все аллергены делят на экзоаллергены, попадающие извне, и эндоаллергены, образующиеся в самом организме (продукты жизнедеятельности, распада и обмена веществ микро– и макроорганизмов). Аллергическая реакция на них при паразитарных болезнях возникает вследствие бурного взаимодействия с иммуноглобулинами Е (IgE) в виде крапивницы, дерматита, ринита/конъюнктивита, диареи, тошноты, рвоты, бронхиальной астмы и даже анафилактического шока. Не случайно этот тип реакции называется анафилактическим типом.

При развитии неэффективной реакции на коже и внутренних органах формируется инфекционная гранулема, в центральной части которой находятся возбудитель, гигантские и эпителиоидные клетки, окруженные валом Т-лимфоцитов, предохраняющих диссеминацию инфекционных агентов.

Развитие инфекционной аллергии (гранулемы) и ее сущность впервые описал Р. Кох. Повторно заражая морскую свинку микобактериями туберкулеза, он обнаружил необычно бурную на них реакцию больного животного. На месте подкожного введения суперинфицирующей дозы в считанные часы некротизировалась ткань, возникала язва, и вместе с ее содержимым удалялись туберкулезные бактерии, что предупреждало их распространение в регионарные лимфоузлы и через кровь во внутренние органы свинки.

Подобное состояние гиперчувствительности характерно для паразитарных болезней, но интенсивность проявления этой аллергической реакции не имеет столь яркого характера, как при туберкулезе.

Являясь по своей природе иммунологическими, аллергические реакции у больных часто усугубляют течение инфекционных процессов. Например, возникновение каверн (полостей) на месте туберкулезных бугорков в легких приводит к диссеминации микобактерий туберкулеза и возникновению новых очагов. Закономерно возникающая гиперчувствительность при инфекционных и паразитарных болезнях позволяет использовать аллергические пробы в их экспресс-диагностике.

Для их постановки необходим специфический аллерген. В качестве аллергена используют стерильные фильтраты бульонных культур микроорганизмов, их гидролизаты, экстракты, гретые культуры и пр. Чаще всего их вводят внутрикожно в ладонную поверхность предплечья, в объеме 0,1 мл. Результаты реакции учитывают через 24–72 ч, оценивая ее по диаметру возникающей на месте введения папулы и ободка покраснения вокруг нее.

В диагностике бактериальных и вирусных инфекций, протозойных инвазий в настоящее время широко применяют: а) методы гибридизации нуклеиновых кислот (НК), в основе которых лежит их способность соединяться с комплементарными нитями (фрагментами); б) полимеразную цепную реакцию (ПЦР) наращивания копий определенного фрагмента ДНК в реакции, катализируемой ДНК-полимеразой.

Метод гибридизации НК. Основной алгоритм ДНК-идентификации микробов состоит в следующем. ДНК, выделенную из прокариот, эукариот и вирусов, культивируемых вне организма, подвергают расщеплению рестрикционной эндонуклеазой. Среди множества образовавшихся ее фрагментов необходимо найти один или несколько, несущих определенную нуклеотидную последовательность, чтобы охарактеризовать ДНК. Для этого разделенные электрофорезом в геле фрагменты ДНК «перепечатывают» на фильтр (нитроцеллюлозу или нейлон), фиксируют на нем и подвергают гибридизации с так называемым «зондом» – олигонуклеотидом, меченным радиоизотопом. Этот зонд представляет собой ранее клонированную с помощью методов генетической инженерии нуклеотидную последовательность гена, подлежащего исследованию, или нуклеотидную последовательность, синтезированную искусственным путем.

Благодаря тому что нуклеотидная последовательность зонда специфически связывается с комплементарными последовательностями фрагмента, зафиксированного на фильтре, указанный фрагмент выявляется путем экспозиции с рентгеновской пленкой.

Подобный процесс гибридизации может происходить между двумя любыми одинарными цепями НК(ДНК: ДНК, РНК: РНК, ДНК: РНК).

Точность такого теста настолько велика, что с его помощью можно выявить комплементарные ДНК-зонду нуклеотидные последовательности даже в тех случаях, когда концентрация их составляет всего лишь одну молекулу на клетку.

Полимеразная цепная реакция. При постановке ПЦР двунитчатая ДНК разделяется на отдельные цепочки термическим путем. Для ее запуска в среду вносят синтетические олигонуклеотиды-праймеры (затравки), состоящие из 10–20 нуклеотидов, способных взаимодействовать с окончаниями нуклеотидных последовательностей обеих цепочек, термостабильную taq-полимеразу, полученную из бактерии Thermus aquaticus, и свободные дезоксинуклеотидтрифосфаты, которые полимераза последовательно присоединяет к затравкам. Полученные ДНК снова разделяют на отдельные цепочки и всю процедуру наработки новых копий повторяют, однако без введения /одполимеразы, поскольку в ПЦР она не затрачивается и, будучи термоустойчивой, не разрушается. С помощью ПЦР из одной молекулы ДНК можно получить миллионы ее копий, идентификацию которых осуществляют методом электрофореза.

Медицинская протистология

Таксономия протистов. Протисты – одноклеточные эукариоты, близкие по строению клеткам сложно организованных животных. Объединены в соответствующее царство, подцарство Protozoa (от греч. protos – первый, zooa – животное) и пять типов, каждый из которых подразделяется на подтипы, надклассы, классы, отряды, роды, виды и штаммы. Для человека патогенны около 20 видов. Наиболее часто встречаемые из них – дизентерийная амеба, жиардии (лямблии), трихомонады, лейшмании, трипаносомы – отнесены к типу Sarcomastigophora (саркодово-жгутиковые); плазмодии малярии и токсоплазмы – к типу Apicomplexa (образующие скопление клеток), а балантидии – к типу Ciliophora (ресничные).

Ультраструктурные и морфологические особенности.

Общая характеристика. Как и грибы, протисты имеют зернистую цитоплазму, в которой содержится сферическое или овальное дифференцированное ядро (у жиардий – два), рибосомы, митохондрии, аппарат Гольджи, различные включения, вакуоли (везикулы, цистерны), фагоцитированные частицы и бактерии.

Форма и размеры. Конфигурация и размеры протистов обусловлены прежде всего плотностью их оболочки. У жгутиковых, ресничных и токсоплазм оболочка ригидна, в результате чего они имеют строго определенную форму. Так, жиардии и трихомонады – грушевидные, лейшмании и трипаносомы – веретенообразные, балантидии – яйцевидные. Размеры жгутиконосцев составляют 10–40 мкм в длину и 2–8 мкм в ширину, а балантидий – 30-150x20-110 мкм.

Паразитирующие внутри клеток особи округляются, уменьшаются в размерах (до 2-6х2-3 мкм) и утрачивают жгутики.

У амеб и плазмодиев малярии пелликула не обладает достаточной плотностью, поэтому при движении паразиты приобретают самую причудливую конфигурацию (от греч. amoibe – изменение, plasma – фигурное образование). Размеры активно передвигающейся вегетативной формы амебы составляют 30–80 мкм в направлении максимальной длины псевдоподий, а у слабоподвижных – просветной и предцистной форм – 12–20 мкм.

Эритроцитарные формы стадийного превращения плазмодия сравнительно невелики – от 1–2 мкм (мерозоиты, кольца) до размера диаметра эритроцита (зрелые шизонты).

Токсоплазми имеют двоякую форму – полулунную в клетках и округлую в цистах.

Специфические органеллы. Балантидии содержат две сократительные вакуоли; дизентерийная амеба – пищеварительные и сократительные вакуоли; жиардии – две эластичные нити (аксостиль); жгутиконосцы – базальные тельца (кинетопла-сты) и связанные с ними ризопласты, переходящие в жгутики, а трипаносомы и трихомонады, кроме того, ундулирующую мембрану

Жиардии в передней части имеют присасывательный диск, токсоплазмы – специальную органеллу, состоящую из коноида и микротрубочек, а балантидии – подобие ротовой полости, названное цитостомой, анальную пору, или цитопрокт, и фибриллы, несущие опорную функцию.

Органеллы движения и способы перемещения. Протесты подтипа Mastigophora передвигаются с помощью жгутиков: у трихомонад их четыре-пять, у жиардий – четыре пары, у лейшманий и трипаносом – по одному. Органеллами движения у балантидий служат многочисленные реснички. Передвижение дизентерийной амебы и плазмодиев малярии осуществляется посредством образования псевдоподий. Токсоплазмы перемещаются с помощью системы микротрубочек, покрывающих тело.

Цисты. В процессе паразитирования многие патогенные протесты образуют цисты, которые предохраняют возбудителей от гибели или обеспечивают длительное пребывание в организме человека. У амеб, жиардий и балантидий инцистирование происходит в просвете кишечника. При этом паразиты округляются, уменьшаются в размерах, покрываются плотной двухконтурной оболочкой.

Зрелая циста амебы меньше просветной формы (8-16 мкм) и отличается от последней, главным образом тем, что в ней содержатся четыре ядра.

Цисты жиардий – тоже с четырьмя ядрами и по размерам такие же, как и у амеб, но овальные.

Балантидии образуют круглые или овальные цисты, диаметр которых достигает 30–60 мкм.

Цисты токсоплазм формируются в тканях и представляют собой покрытые клеточной оболочкой округлые образования размером 50-200 мкм, сплошь наполненные цистозоитами.

Способ размножения. Жгутиковые размножаются поперечным и продольным делением, реже – половым путем; балантидии – поперечным делением, половым путем; дизентерийная амеба – простым делением; плазмодии малярии и токсоплазми – половым и бесполым путем.

Микроскопия и способы выявления. Обнаружение в патологических материалах патогенных протистов особых трудностей не представляет. Для этого исследуют мазки и дополнительно – толстую каплю крови. В препаратах, окрашенных по Романовскому – Гимзе, цитоплазма паразитов – голубая; ядро, блефаропласт и жгутики – красные. Испражнения исследуют в свежем виде с использованием нагревательного столика, что обеспечивает выявление псевдоподий у дизентерийных амеб и ресничек у балантидий.

Для обнаружения амебных цист к фекалиям добавляют концентрированный раствор Люголя, контрастирующий внутриклеточные структуры.

Граф 1

Таксономия. Дизентерийная амеба, или Entamoeba histolytica, являющаяся возбудителем амебиаза, была открыта в 1875 г. Ф.А. Лешем и подробно изучена в 1903 г. Ф. Шаудиным. Видовое название Entamoeba histolytica (от греч. entos – внутри, amoibe – изменение формы) получила потому, что, развиваясь в подслизистом слое и просвете толстой кишки, вызывает расплавление (лизис) тканей.

Рис. 11. Entamoeba histolytica (а) и Entamoeba coli (6):1 – тканевая форма; 2 – большая вегетативная; 3 – просветная; 4 – 4-ядерная циста;5 – вегетативная форма; 6 – 8-ядерная циста

Относится к подтипу Sarcodina (от греч. sarcodes – состоящий из мяса), надклассу Rhizopoda (корненожек), классу Lobosea, подклассу Gimnamoebia, отряду АтоеЫпа (т. е. с лопастевидными псевдоподиями «голые» амебы), семейству Endamoebidae.

Морфология. В цикле развития энтамеб различают две стадии: вегетативную (тканевую, большую, просветную, предцистную) и покоящуюся, или стадию цист (рис. 11, а). Все они имеют вид ядросодержащих телец. При этом вегетативные формы энтамеб (7, 2, 3) содержат 1 ядро, а цисты – от 1–3 (молодые) до 4 (зрелые); в центре каждого из них находится хорошо контурируемая карно сома в виде зернышка.

Разные формы амеб отличаются по размерам, структуре цитоплазмы и наличию фагоцитируемых частиц. Так, диаметр тканевых энтамеб не превышает 20–25 мкм, у больших вегетативных форм (forma magna) он колеблется от 30 до 60 мкм, у просветных (forma minuta) и пред цистных – уменьшается до 20–15, а у цист – до 9 мкм.

Цитоплазма тканевых и больших вегетативных форм неоднородна, так как состоит из хорошо преломляющей свет гомогенной эктоплазмы (внешнего слоя) и располагающейся под ней тонкозернистой эндоплазмы. У остальных форм амеб цитоплазма однослойная: вакуолизированная – у просветных и тонкозернистая – у предцистных форм и цист.

В цитоплазме больших вегетативных форм энтамеб часто содержатся эритроциты, у других форм – переваренные остатки пищи, в цистах – гликоген и хроматоидные палочки.

Благодаря образованию псевдоподий энтамебы обладают медленным поступательным движением, но наиболее характерно оно для больших вегетативных форм.

Клиника и эпидемиология. Амебиаз – острая или хроническая кишечная инвазия, клинически трудно дифференцируемая от бактериальной дизентерии: температура, как правило, субфебрильная или даже нормальная; интоксикация – незначительная.

Острая форма амебиаза начинается с недомогания, болей в животе и поноса с выделением жидких фекалий, имеющих вид малинового желе. Проникая в подслизистую оболочку, амебы могут вызывать кратерообразные язвы.

Особую опасность представляют осложнения амебиаза перфоративным перитонитом, абсцессами печени, легких и головного мозга. Описаны амебные поражения промежности, ягодиц, влагалища и шейки матки.

Заболевание распространено в тропических и субтропических регионах, встречается на Кавказе и в Средней Азии.

Источником амебиаза в преобладающем большинстве случаев являются амебоносители, выделяющие с фекалиями цисты. Попадая во внешнюю среду, цисты сохраняются в почве около 30 сут, легко переносят низкие температуры, устойчивы к действию хлора и дезинфицирующих веществ, кислому содержимому желудка. Вследствие этого заражение амебиазом происходит фекально-оральным путем при употреблении воды, овощей и других пищевых продуктов, зараженных спорами цистоносителей. Большую роль в распространении амебиаза играют мухи.

Лабораторная диагностика. В диагностике амебиаза решающее значение имеет обнаружение в фекалиях вегетативных форм Е. histolytica и ее цист. При этом на высоте заболевания обнаруживаются энтамебы-эритрофаги, а в период выздоровления – предцистные формы и, главное, 4-ядерные цисты.

При микроскопическом исследовании нативных препаратов из фекалий с использованием нагревательного столика у амеб удается обнаружить псевдоподии и поступательное движение, а при добавлении концентрированного раствора Люголя – зерна гликогена в цистах.

В гистологических срезах пораженных тканей и мазках из фекалий, обработанных железным гематоксилином или гематоксилин-эозином, цитоплазма вегетативных энтамеб окрашивается в серый цвет, а оболочка, ядра, кариосомы и эритроциты – в черный.

В заключение следует отметить, что в кишечнике человека обитает неболезнетворная Е. coli, которая намного крупнее дизентерийной, в ее цитоплазме содержатся бактерии, лейкоциты, но отсутствуют эритроциты; псевдоподии наблюдаются редко, а размер ее цист намного больше, чем у дизентерийной, и содержат они не 4, а 8 ядер (рис. 11, б). При внекишечных формах амебиаза прибегают к определению специфических антител в РИГА, РИФ, ИФА.

Культивирование. Выращивают Е. histolytica на синтетической среде Павловой, содержащей в 500 мл дистиллированной воды 4,25 г NaCl, 0,3 г Na₂HPO₄, 0,5 г КН₂PO₄, 26 мл лошадиной сыворотки и 10 мг крахмала (навеска на кончике скальпеля). Пышный рост энтамеб получают на ней спустя 2–3 сут выращивания.

Патогенность. Вирулентность амеб варьирует. В некоторых случаях можно воспроизвести экспериментальный амебиаз. Наиболее чувствительны к дизентерийным амебам котята и белые крысы. Заражая их через прямую кишку, получают характерные изъязвления слизистой оболочки и даже абсцессы печени.

Лечение. В лечении амебиаза широко используют системные тканевые амебоциды – метронидазол (трихопол), тинидазол, орнидазол, а при возникновении абсцессов печени – дегидроэметин или хлорохин. Все они нарушают синтез нуклеиновых кислот энтамебы. В частности, метронидазол, отличающийся универсальной амебоидной активностью в отношении любой формы Е. histolytica, подавляет синтез ее НК в результате прямого взаимодействия с нуклеотидами и множественного нарушения структуры ДНК под действием накапливающихся нитрозогидроксиламиногрупп (образуются вследствие восстановления нитрогруппы препарата).

После завершения курса лечения амебиаза отмеченными препаратами применяют просветные амебоциды, в частности этофамид для элиминации оставшихся в кишечнике амеб.

Граф 2