Текст книги "Медицинская паразитология с энтомологией"

Современная иммунология разработала большой комплекс простых и очень точных иммунологических реакций, широко используемых не только в диагностике инфекционных болезней и инвазий, но также при оценке иммунологической реактивности организма, аллергии, аутоиммунных и других иммунопатологических процессов.

Серологическими называют такие реакции, для постановки которых используют сыворотку (serum), содержащую антитела. В их основе лежит специфическое взаимодействие антитела с антигеном.

Серологические реакции применяют: а) для идентификации микроорганизмов, токсинов, любого антигена с помощью известных иммунных диагностических сывороток; б) для определения природы антител в сыворотке крови с помощью известных антигенов-диагностикумов. При этом метод определения видовой принадлежности (идентификация) микробов называют серологическим типажем, а способ определения титра антител в сыворотке крови – серологической диагностикой.

Основными серологическими реакциями являются традиционные реакции агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента, нейтрализации и различные их модификации.

Общие закономерности серологических реакций: 1) реакции ставятся in vitro; 2) проявляются при иммунологическом соответствии (гомологичности) антигена и антитела, в оптимальных температурных условиях и pH среды; 3) протекают в две фазы: а) взаимодействие антигена с антителом – специфическая фаза; б) образование комплекса антитело – антиген – неспецифическая фаза.

Иммунные диагностические сыворотки получают путем многократного введения животным в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов (паразитов), продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов.

После определенного цикла иммунизации животных делают пробное кровопускание (2–3 мл) и определяют титр сыворотки. Если в сыворотке содержится достаточное количество антител, делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37 °C на 4–6 ч для ускорения свертывания, затем – в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют консерванты (мертиолят, хинозол), определяют титр антител, проверяют на стерильность и разливают в ампулы.

Используются неадсорбированные и адсорбированные диагностические сыворотки.

Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но они способны давать групповые (перекрестные) реакции. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой специфичностью действия, но имеют низкий титр антител – от 1:40 до 1:320.

К диагностическим сывороткам относятся: 1) агглютинирующие сыворотки, применяемые для определения рода, вида и серовара микроорганизмов; 2) преципитирующие сыворотки, предназначенные для выявления высокодисперсных антигенов и токсинов; 3) гемолитическая сыворотка, используемая в реакции связывания комплемента; 4) антитоксические сыворотки, нейтрализующие токсины; 5) антивирусные сыворотки. Выпускают также сыворотки, меченные флюорохромами, ферментами, радиоизотопами, которые позволяют с высокой степенью точности обнаружить даже следы антигена.

В качестве антигенов-диагностикумов в серологических реакциях применяют взвеси живых или убитых микробов, продукты их расщепления и токсины. В ряде случаев используют экстракты или выделенные химическим путем антигены из микроорганизмов и тканей животных.

В основе проявления всех серологических реакций лежит образование иммунных комплексов, регистрируемых невооруженным глазом или с помощью лупы, микроскопа, специальной аппаратуры (например, агглютиноскопа, спектрофотометра, счетчика излучений) или индикатора.

Агглютинацией называется склеивание микробов (клеток) при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Реакцию агглютинации (РА) используют в серо-типаже микроорганизмов, главным образом бактерий, и в серодиагностике инфекционных болезней. Для ее постановки необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин); 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

В качестве антигена в РА применяют свежевыросшую взвесь живых или убитых формалином, спиртом, нагреванием культур (диагностикумов).

Для получения агглютинирующих сывороток иммунизируют кроликов. При этом им 5–7 раз подкожно, а затем внутривенно с интервалами 2–7 сут в возрастающих дозах вводят убитые бактерии. Заканчивают курс иммунизации животных 2–3 инъекциями живых бактерий. Через неделю определяют титр сыворотки – максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки недостаточен, иммунизацию продолжают.

Полученные таким путем агглютинирующие сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для определения их вида надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микробу в том случае, если агглютинирует его как минимум до половины титра.

Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости их сильно разводить.

Развернутая РА для серотипажа микробов. Ее ставят следующим образом: в агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл неадсорбированной сыворотки, разведенной 1:100, и, перемешав, 1 мл переносят во вторую, из второй – в третью и т. д. Получив двукратные разведения диагностической сыворотки от 1:100 до 1:1600 и более, вносят в них по 1–2 капле 2-миллиардной взвеси бактерий. Контролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуемая сыворотка без него. Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °C, затем осуществляют предварительный учет, начиная с контролей.

Отсутствие агглютинации в контроле и наличие взвешенных хлопьев в 2–3 и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции (рис. 3). Окончательные результаты учитывают через 18–20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре.

Рис. 3. Развернутая реакция агглютинации

Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» – сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++», «++», «+» – убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка.

Заостряя внимание на агглютинате, следует указать, что для обнаружения неорганизованных антигенов простейших и гельминтов используют латекс-агглютинацию, адсорбируя их видовые иммуногены или гаптены на латекс-частицах, которые, реагируя с антителами, склеиваются в виде мелкозернистых осадков, какие образуются, например, при агглютинации мельчайших бактерий и риккетсий.

Развернутая РА для серодиагностики инфекционных болезней. Обнаружение в сыворотке больных антител к определенным видам микроорганизмов – косвенный, но очень важный показатель, так как они образуются только под воздействием возбудителя заболевания. Техника постановки развернутой РА для серодиагностики такая же, как в серотипаже. Получив сыворотку больных, ее, как и диагностическую, разводят изотоническим раствором натрия хлорида от 1:100 до 1:1600.

В качестве антигена в этой реакции используют диагностику-мы – заведомо известные взвеси убитых бактерий, с которыми безопасно работать.

Учитывается она так же, как развернутая РА для идентификации бактерий. Обычно клинический диагноз подтверждает наличие агглютината в титре 1:200 и выше. При агглютинации бактерий в более низких титрах сыворотки, что может происходить за счет нормальных антител, имеющихся у здоровых людей или больных другим заболеванием, реакцию агглютинации ставят повторно спустя 3–4 дня с расчетом выявления нарастания титра антител. Нередко динамику нарастания антител прослеживают с самого начала заболевания, для чего исследуют «парные» сыворотки, полученные от больного в разгар заболевания и спустя 7-10 и более суток, когда титр агглютининов под воздействием патогенного микроба повышается в 2–4 и более раз.

В тех случаях, когда в качестве антигена предполагается использовать мельчайшие микроорганизмы, например микоплазмы и вирусы или экстракты и лизаты бактерий, другие высокодисперсные вещества, комплексы которых с агглютининами увидеть невозможно даже в агглютиноскопе, прибегают к постановке реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), сорбируя их на бараньих эритроцитах. Ставится она в лунках полистироловых планшет. По чувствительности и наглядности результатов намного превосходит развернутую РА.

РИГА для серодиагностики инфекционных болезней и инвазий. Для обнаружения антител в сыворотках больных готовят эритроцитарные антигенные диагностикумы. Для этого бараньи эритроциты в течение 15 мин обрабатывают раствором таннина в разведении 1:20 000-1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют 2 ч при температуре 37 °C. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают 0,85 %-ным раствором натрия хлорида и в объеме 0,1–0,25 мл 0,5 %-ной взвеси добавляют к сыворотке, разведенной от 1:10 до 1:1280 и разлитой по 0,25-0,5 мл в лунки планшет (рис. 4).

В качестве контроля используют взвеси интактных и нагруженных специфическим антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо отрицательную и положительную реакции.

Рис. 4. РИГА для серодиагностики инфекционных болезней: Эр. Аг – эритроцитарно-антигенный диагностикум; Ат – антитела

Результаты учитывают через 2 ч после инкубации в термостате. Оценивают РИГА плюсами: «++++» – эритроциты равномерно покрывают всю лунку планшеты в виде зонтика с неровными краями; «+++», «++» – осадок эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из несклеившихся эритроцитов; «+» – в основном видны не склеившиеся эритроциты.

Рис. 5. РИГА для выявления высокодисперсных антигенов: Эр. Ат – эритроцитарно-антительный диагностикум; Аг – антигены

При отрицательной реакции эритроциты спонтанно агглютинируют в виде плотного диска («пуговицы») на дне лунок.

РИГА для идентификации високодисперсних антигенов. Для определения видовой принадлежности антигенов готовят антительный диагностикум, сорбируя на эритроцитах иммуноглобулины известной иммунной сыворотки. Параллельно в лунках полистироловых пластин делают двухкратные разведения антигена в объеме 0,25-0,5 мл и к каждому из них добавляют 0,1–0,25 мл сенсибилизированных антителами эритроцитов (рис. 5). Учет и оценка антительной РИГА для идентификации антигенов производится в те же сроки и по тем же показателям, которые используются в аналогичной ей реакции для серодиагностики болезней.

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора антигена (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых количествах, которые не обнаруживаются в химических реакциях.

Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические частицы белково-полисахаридной природы, экстракты из микроорганизмов, органов и тканей, продукты распада бактериальных клеток, их лизаты, фильтраты патологического материала. Так как преципитиногены обладают термоустойчивостью, то для их извлечения материалы подвергаются кипячению. В РП используются жидкие и прозрачные антигены.

Преципитирующие сыворотки обычно получают путем гипериммунизации кроликов в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Титр преципитирующей сыворотки в отличие от титра других диагностических сывороток определяется максимальным разведением антигена, который преципитируется в ней. Это объясняется тем, что преципитиноген, участвующий в РП, содержит в единице объема гораздо больше частиц, чем содержится антител в преципитирующей сыворотке такого же объема. В связи с этим преципитирующие сыворотки выпускают с титром не ниже 1:100 000.

Реакция кольцепреципитации Асколи. В узкую пробирку диаметром 0,5 см с неразведен-ной преципитирующей сывороткой в объеме 0,5–1 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена. Пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости.

Рис. 6. Реакция преципитации: а – реакция Асколи: 1 – опыт;2 – контроль; б – реакция Оухтерлони: 1 – специфическая иммунная сыворотка; 2 – нормальная сыворотка;3 – известный антиген; 4 – неизвестный антиген

Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1–2 ч или через 20–24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета (рис. 6, а). Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Реакцию кольцепреципитации широко используют не только в диагностике инфекционных болезней бактериальной природы, но и в судебной медицине – для определения видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен; в санитарной практике – при выявлении фальсификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. С ее помощью удается определить степень родства различных видов животных и растений.

Реакция преципитации Оухтерлони. Так как реакцию Оухтерлони ставят на чашках Петри в лунках пластинчатого агара, то ее также называют реакцией преципитации в агаровом геле (РПГ). При этом исследуемые и известные антигены вносятся в одни противостоящие лунки, а иммунные и нормальные сыворотки – в другие, после чего РПГ помещают на 24-48-72 ч в термостат. Диффундируя в агар навстречу друг другу, антитела и антигены при положительной реакции образуют иммунные комплексы, визуально обнаруживаемые в виде белых полос между лунками (рис. 6, б). В различных модификациях реакция

Оухтерлони используется в диагностике вирусных и бактериальных заболеваний.

При постановке реакции гемолиза используют бараньи эритроциты, гемолитическую сыворотку, содержащую специфические к ним гемолизины, и комплемент. Протекает она в две фазы: в первой – эритроциты взаимодействуют с гемолизинами сыворотки, во второй – сенсибилизированные лизинами эритроциты растворяются под действием комплемента.

Гемолиз происходит при наличии строго определенного соотношения используемых в реакции ингредиентов (табл. 1).

Бараньи эритроциты для реакции гемолиза получают в день ее постановки. Кровь дефибринируют во флаконе со стеклянными бусами, далее готовят 3 %-ную взвесь, отмывая эритроциты изотоническим раствором натрия хлорида при центрифугировании.

Гемолитическую сыворотку готовят в производственных институтах, вводя кроликам парентерально 3–4 раза по 2–5 мл 50 %-ной взвеси бараньих эритроцитов. Для реакции гемолиза пригодна сыворотка с титром не ниже 1:1200, но в опыт берется в тройном титре, т. е., если титр гемолитической сыворотки равен 1:1200, то используют титр 1:400.

Таблица 1.

Схема постановки реакции гемолиза

Титром гемолитической сыворотки называют ее максимальное разведение, которое в присутствии комплемента при 37 °C вызывает полный гемолиз бараньих эритроцитов в течение 1 ч.

В качестве комплемента применяют сыворотку крови морских свинок, точнее, производственный сухой комплемент, который при правильном хранении не теряет своей активности 1–2 года.

Учет реакции производят через 1 ч после инкубации пробирок в термостате при температуре 37 °C.

Реакцию гемолиза используют для определения количества комплемента в сыворотке крови людей, но чаще – как индикатор в реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК). Сложная двухэтапная реакция, в которой используются пять ингредиентов, составляющих две системы: антиген, антитело и комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащие специфические к ним антитела (вторая, или гемолитическая индикаторная система).

Взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, что сопровождается активацией (адсорбцией) на нем комплемента, но визуально обнаружить это невозможно. Ввиду чего Дж. Борде и О. Жангу предложили на втором этапе постановки реакции в качестве индикатора фиксации комплемента на комплексе антиген – антитело использовать гемсистему, которая, являясь иммунным комплексом, тоже способна связывать его.

В конечном итоге возможны два результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу, а комплемент связывается образовавшимся комплексом, гемолиза эритроцитов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену комплемент, оставаясь свободным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз (рис. 7).

Как и другие серологические реакции, РСК может быть использована для выявления специфических антител по известному антигену или для определения антигена по известным антителам.

Накануне постановки РСК исследуемая сыворотка прогревается на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин для инактивации в ней собственного комплемента, а затем разводится, начиная с 1:5.

Рис. 7. Реакция связывания комплемента: I – положительная; II, III – отрицательные; Ат – антитело; Аг – антиген; К – комплемент; Эр – эритроциты барана

Антигеном для РСК могут быть культуры убитых бактерий, их лизаты, экстракты из патологически измененных и нормальных органов, тканевые липиды, вирусы и вируссодержащие материалы. Сухой комплемент или свежая сыворотка морской свинки перед титрованием разводится 1:10. Гемсистема, или смесь равных объемов гемолитической сыворотки в тройном титре и 3 %-ной взвеси бараньих эритроцитов по осадку, для сенсибилизации эритроцитов выдерживается в термостате при температуре 37 °C в течение 30 мин.

Перед постановкой РСК комплемент и антиген титруются. Необходимость в титровании комплемента диктуется тем, что его содержание в крови морских свинок непостоянно. Для этого основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и в каждую из них прибавляют 0,85 %-ный раствор натрия хлорида, доводя объем до 1,5 мл. Пробирки ставят в термостат при температуре 37 °C на 45 мин, после чего к ним добавляют гемсистему и вновь инкубируют в термостате 30 мин. Затем определяют титр комплемента – наименьшее его количество, вызывающее гемолиз (табл. 2).

Если, например, он будет составлять 0,25 мл, то в РСК вводят рабочую дозу комплемента, которая на 20–30 % выше титра, т. е. используют следующую дозу (0,3 мл), вызвавшую полный лизис эритроцитов, доводя ее до 0,5 мл изотоническим раствором натрия хлорида.

Таблица 2.

Схема титрования комплемента

Необходимость в титровании антигена, используемого в РСК, связана с тем, что он может адсорбировать некоторое количество комплемента, т. е. обладать антикомплементарными свойствами. Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающихся дозах от 0,5 до 0,05 мл и добавляют 0,85 %-ный раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1 мл. Затем в каждую пробирку доливают по 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37 °C. После этого во все пробирки добавляют по 1 мл гемсистемы, вновь инкубируют в термостате 1 ч и учитывают результаты (табл. 3).

Таблица 3.

Схема титрования антигена

Титром антигена считается его наименьшая доза, при которой наступает полный гемолиз. В РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2-2/3 титра. Если титр комплемента в присутствии антигена снижается более чем на 30 %, то он непригоден для реакции.

Оттитровав комплемент и антиген, ставят основной опыт РСК (табл. 4).

Для этого берут три пробирки, в каждую из них вносят по 0,5 мл соответствующих ингредиентов.

На начальном этапе в первую (опытную) наливают все три компонента РСК – сыворотку, антиген, комплемент; во вторую – сыворотку, комплемент, а вместо антигена – изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки); в третью – антиген, комплемент, а вместо сыворотки – тот же раствор натрия хлорида (контроль антигена). Пробирки ставят в термостат при температуре 37 °C на 1 ч.

Таблица 4.

Схема постановки реакции связывания комплемента

На втором этапе реакции в каждую пробирку вносят гемсистему, и после перемешивания пробирки вновь помещают в термостат на то же время, а затем учитывают результаты РСК.

Интенсивность реакции отмечается плюсами: «++++» – полная задержка гемолиза, жидкость в пробирке бесцветна, все эритроциты оседают на дно (резко положительная РСК); «+++», «++» – слабый гемолиз, уменьшенное количество эритроцитов в осадке (положительные РСК); «+» – выраженный гемолиз, жидкость окрашена в розовый цвет, незначительное количество эритроцитов в осадке (слабоположительная РСК). Отрицательная РСК обозначается знаком «-». При этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет цвет алой, или «лаковой», крови.

Чувствительность РСК повышается, если связывание комплемента проводить на холоде при температуре 4 °C в течение 18–20 ч. В такой модификации РСК используется в диагностике вирусных инфекционных болезней. Антигены из высоковирулентных вирусов инактивируют добавлением слабых концентраций формалина (1:500-1:1000) или УФ-облучением.

Несмотря на сложность постановки РСК нашла широкое применение в диагностике хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.